豬骨骼肌發(fā)育相關(guān)新基因家族BTG-TOB的克隆及功能研究.pdf

1、提高豬生產(chǎn)性狀一直以來都是育種學(xué)家們追求的目標(biāo)之一。豬瘦肉產(chǎn)量和質(zhì)量主要取決于胚胎發(fā)育期肌纖維數(shù)量的增生和生后期肌纖維體積的膨大。豬肌肉生長速度與胚胎期形成的肌纖維數(shù)目呈正相關(guān),同時(shí)也受肌纖維中蛋白質(zhì)的合成和降解速度差異的影響,但胚胎肌發(fā)生時(shí)期形成的肌纖維數(shù)量是動(dòng)物產(chǎn)肉量的重要決定因素。另一方面,肌纖維的肥大又與肌肉應(yīng)激或肉質(zhì)下降等問題有關(guān)。因此,如何最有效地平衡肌肉生長速度與肌肉品質(zhì)需要我們對肌纖維的發(fā)育有一個(gè)全面深入的了解。

2、　　 本實(shí)驗(yàn)室在以通城和長白豬胚胎發(fā)育不同時(shí)期的骨骼肌構(gòu)建的LongSAGE文庫中發(fā)現(xiàn)了一大批差異表達(dá)基因,本研究在此基礎(chǔ)上,選取對早期肌纖維增殖有顯著影響的BTG/TOB基因家族,開展了5個(gè)新基因的克隆、定位及其功能研究工作,得到如下結(jié)果:
　　 1.以LongSAGE文庫中差異表達(dá)標(biāo)簽(tags)為基礎(chǔ),結(jié)合生物信息學(xué)與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證克隆獲得了豬BTG1、BTG2和BTG3基因包含完整CDS的cDNA序列以及BTG4基因的部分D

3、NA序列和TOB2基因的靠近3’端部分cDNA序列。
　　 2.推導(dǎo)了豬BTG1、BTG2和BTG3基因的氨基酸序列,并利用生物信息學(xué)方法預(yù)測了它們的結(jié)構(gòu)和功能,發(fā)現(xiàn)它們除具有BTG/TOB基因家族所共有的boxA和boxB保守結(jié)構(gòu)域外,還含有幾個(gè)蛋白激酶的磷酸化位點(diǎn)。結(jié)合氨基酸同源性,我們構(gòu)建了該三個(gè)基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果表明,三個(gè)基因分別聚為三個(gè)明顯的分支,其中BTG1和BTG2進(jìn)化關(guān)系更近一些。
　　 3.利用RH

4、克隆板對上述5個(gè)基因進(jìn)行了染色體定位,分別將BTG1、BTG2、BTG3、BTG4及TOB2基因定位在SSC5q24-25,9p11-q11,13q47,9p21和5p15區(qū)域。
　　 4.運(yùn)用RT-PCR方法檢測了BTG1,BTG2和BTG3三個(gè)基因在成年長白和通城豬心臟、胃、脾臟、肺、腎、肌肉中的表達(dá)情況。檢測結(jié)果表明,BTG1和BTG3基因在表達(dá)模式上類似,都在長白豬心臟和骨骼肌中低表達(dá),而在通城豬高表達(dá),在兩個(gè)品種的胃、

5、脾臟、肺和腎中表達(dá)都較高；BTG2基因在長白和通城豬的心臟中高表達(dá),骨骼肌中表達(dá)稍低。
　　 5.運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR方法,我們利用與半定量PCR相同的反轉(zhuǎn)錄引物在通城和長白豬胚胎發(fā)育33天、65天和90天的背最長肌cDNA中對三個(gè)基因的表達(dá)情況作了檢測。檢測結(jié)果表明,BTG1基因和BTG3基因在兩個(gè)品種三個(gè)時(shí)期的表達(dá)模式完全一樣,它們在通城豬三個(gè)胚胎時(shí)期的表達(dá)量都遠(yuǎn)大于在長白豬中的表達(dá)量(p<0.01),通城豬中的表達(dá)趨勢是先下

6、調(diào)再上調(diào)(p<0.05),在長白豬三個(gè)胚胎時(shí)期的表達(dá)差異不顯著；BTG2基因則在通城豬胚胎三個(gè)時(shí)期的表達(dá)是先上調(diào)再下調(diào)(p<0.05),在長白豬中的表達(dá)是先上調(diào)(p<0.05),在65天和90天的表達(dá)差異不顯著(p>0.05)。并且BTG2基因在33天和90天的表達(dá)都是長白豬大于通城豬(p<0.05),65天時(shí)則在兩個(gè)品種的表達(dá)沒顯著差異。
　　 6.運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR方法,檢測了鼠源BTG1,BTG2,BTG3和Myogeni

7、n基因在C2C12細(xì)胞分化不同時(shí)期的表達(dá),Myogenin基因用作成肌細(xì)胞分化的信號(hào)分子。結(jié)果顯示BTG1和BTG3基因與Myogenin的表達(dá)趨勢完全一致(p<0.05),而BTG2基因則在五個(gè)時(shí)期呈現(xiàn)波浪式表達(dá)(p<0.05)。
　　 7.發(fā)現(xiàn)了豬BTG1、BTG2和BTG3基因可用PCR-RFLP方法檢測的4個(gè)SNP位點(diǎn),其中位于BTG1基因3’UTR區(qū)的兩個(gè)SNP位點(diǎn)和位于BTG2基因第一外顯子的一個(gè)SNP位點(diǎn)都沒有改變

8、氨基酸,BTG3基因的SNP位于第五外顯子,該位點(diǎn)堿基C到T的改變造成氨基酸由脯氨酸變?yōu)榻z氨酸。
　　 8.對上述四個(gè)SNP位點(diǎn)在大白、長白、杜洛克、通城、二花臉、清平和江西玉山豬中進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析,分析結(jié)果表明四個(gè)SNP位點(diǎn)在中外豬品種中的分布存在顯著差異。
　　 9.在我室與通城縣畜牧局合作組建的試驗(yàn)豬群體中,對四個(gè)SNP與生產(chǎn)性狀進(jìn)行了初步關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示,BTG1基因3’UTR區(qū)PsuL-RFLP位點(diǎn)的基因型

9、與肩部膘厚、6-7肋間膘厚、屠宰率以及肉色存在顯著關(guān)聯(lián),該區(qū)Bsh1236I-RFLP位點(diǎn)的基因型與肉色及肌內(nèi)脂肪含量存在顯著關(guān)聯(lián)；BTG2基因第一外顯子Mval-RFLP多態(tài)性位點(diǎn)的基因型與肩部膘厚、肉色及肌肉剪切力存在顯著關(guān)聯(lián)；BTG3基因第五外顯子Mval-RFLP多態(tài)性位點(diǎn)的基因型與肌肉剪切力存在顯著關(guān)聯(lián)。
　　 10.成功克隆了豬BTG1基因上游約1.6kb的啟動(dòng)子序列,并構(gòu)建了4個(gè)pGL3報(bào)告基因載體并用生物信息學(xué)方

10、法對它的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測。發(fā)現(xiàn)了許多影響細(xì)胞周期和肌纖維發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子,如Forehead基因家族,AP-1樣因子,SP1樣因子,Myod,PAX家族等。對啟動(dòng)子的預(yù)測結(jié)果表明,豬的BTG1基因可能是對肌肉早期發(fā)育有重要影響的基因。
　　 本研究初步結(jié)果表明,BTG基因家族對骨骼肌早期發(fā)育有較明顯的影響,作為豬骨骼肌發(fā)育相關(guān)的候選基因?qū)ζ涔δ苓M(jìn)行深入研究,必將有助于豐富豬分子育種材料并給豬肉生產(chǎn)帶來實(shí)質(zhì)性的幫助。