豬骨骼肌miRNA轉(zhuǎn)錄組分析及miR-486功能的初步研究.pdf

1、MicroRNA是長(zhǎng)度約為22nt的小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA參與肌肉組織生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的一系列生物過(guò)程，包括肌肉細(xì)胞的增殖、分化、肥大、肌纖維類(lèi)型轉(zhuǎn)換及肌肉疾病的發(fā)生。相對(duì)于源自丹麥的長(zhǎng)白豬，廣西巴馬小型豬具有體型矮小、生長(zhǎng)速度慢、瘦肉率低、肉質(zhì)更好的特征。目前，比較小型豬與正常體型豬肌肉組織發(fā)育相關(guān)的miRNA研究報(bào)道較少。探索巴馬小型豬和長(zhǎng)白豬骨骼肌miRNA的差異表達(dá)，對(duì)于解析品種間肌肉生長(zhǎng)發(fā)育差異分子機(jī)

2、理具有重要的意義。本研究分別構(gòu)建巴馬小型豬和長(zhǎng)白豬出生后1日齡和180日齡背最長(zhǎng)肌組織小RNA文庫(kù)，利用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定肌肉發(fā)育相關(guān)的miRNA，檢測(cè)miRNA的表達(dá)譜，并對(duì)差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行注釋和信號(hào)通路富集，分析目的miRNA的潛在功能。采用QRT-PCR對(duì)10個(gè)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行了驗(yàn)證，并檢測(cè)它們的組織表達(dá)譜及在背最長(zhǎng)肌中的發(fā)育性變化規(guī)律，分析它們?cè)诩∪獍l(fā)育過(guò)程中的可能功能。豬miR-486的表達(dá)和功能研究還未見(jiàn)

3、報(bào)道，為了解析miR-486的表達(dá)差異，本研究利用RACE技術(shù)克隆miR-486宿主基因sANK1的cDNA全長(zhǎng)序列，對(duì)miR-486與其宿主基因的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，并分析其啟動(dòng)子的功能;為了解豬miR-486的生物學(xué)功能，本研究對(duì)miR-486進(jìn)行了靶基因預(yù)測(cè)和功能分析，檢測(cè)巴馬小型豬和長(zhǎng)白豬背最長(zhǎng)肌中靶基因涉及的IGF-1-PI3K/AKT-mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律，在C2C12成肌細(xì)胞上驗(yàn)證miR-486對(duì)肌肉發(fā)育的影

4、響和可能的機(jī)制。本研究獲得的主要結(jié)果總結(jié)如下:1.巴馬小型豬與長(zhǎng)白豬背最長(zhǎng)肌小RNA文庫(kù)測(cè)序。分別構(gòu)建1日齡和180日齡巴馬小型豬(NB和AB組)及長(zhǎng)白豬(NL和AL組)背最長(zhǎng)肌小RNA文庫(kù)，并進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)果顯示4個(gè)小RNA文庫(kù)分別獲得的高質(zhì)量序列讀數(shù)分別為11955887、11975536、11955924和11975035，其中絕大多數(shù)序列長(zhǎng)度在22nt，與哺乳動(dòng)物miRNA的大小一致。去除冗余序列后4個(gè)文庫(kù)獲得長(zhǎng)度為18nt

5、-30nt的clean reads讀數(shù)分別為11925255、11934400、11934796和11931683，對(duì)應(yīng)的種類(lèi)數(shù)分別為125347、121867、152944和136903。四個(gè)文庫(kù)中有大約85％的total序列與豬基因組匹配，50％以上的unique序列未與豬基因組匹配。NB與AB、NL與AL、NB與NL和AB與AL文庫(kù)間共有序列種類(lèi)分別為30588、31861、39840和33533。分類(lèi)注釋顯示，NB、AB、NL和

6、AL文庫(kù)中與已知的豬miRNA序列相匹配的序列數(shù)分別為85.52％、87.05％、81.94％和87.13％，未被注釋的序列數(shù)分別占序列總數(shù)的13.11％、11.79％、16.08％和11.76％。2.巴馬小型豬與長(zhǎng)白豬背最長(zhǎng)肌小RNA表達(dá)譜及差異分析。應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)分析小RNA表達(dá)譜，從四個(gè)文庫(kù)中共鑒定獲得292種已知的豬miRNA，利用Mireap軟件預(yù)測(cè)獲得86個(gè)候選miRNA，并采用RT-PCR成功驗(yàn)證了其中的9個(gè)候選miR

7、NA。miRNA差異表達(dá)分析顯示:180日齡巴馬小型豬與1日齡巴馬小型豬相比，有151個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中18個(gè)顯著上調(diào)，133個(gè)顯著下調(diào);180日齡長(zhǎng)白豬與1日齡長(zhǎng)白豬相比，有161個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中21個(gè)顯著上調(diào)，140個(gè)顯著下調(diào)。1日齡巴馬小型豬與1日齡長(zhǎng)白豬相比，有29個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中20個(gè)顯著上調(diào)，9個(gè)顯著下調(diào);180日齡巴馬小型豬與180日齡長(zhǎng)白豬相比，有30個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中顯著上調(diào)

8、26個(gè)，顯著下調(diào)4個(gè)。為了驗(yàn)證小RNA測(cè)序結(jié)果，克隆了豬10個(gè)miRNA的成熟體序列，并進(jìn)行QRT-PCR檢驗(yàn)，證實(shí)了小RNA文庫(kù)測(cè)序的結(jié)果可靠。3.差異表達(dá)miRNA的功能分析。差異表達(dá)小RNA的GO注釋分析結(jié)果顯示，NB與NL樣品間差異miRNA靶基因在細(xì)胞成分中顯著富集;AB與AL樣品間差異miRNA靶基因在生物學(xué)過(guò)程和分子功能中顯著富集。KEGG通路分析結(jié)果顯示巴馬小型豬與長(zhǎng)白豬在1日齡中差異表達(dá)miRNA靶基因顯著富集到12個(gè)

9、通路，包括Notch信號(hào)通路、擴(kuò)張型心肌病和肥厚性心肌病等;巴馬小型豬與長(zhǎng)白豬在180日齡中差異表達(dá)的miRNA靶基因顯著富集到14個(gè)通路，包括磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、乙醛酸和二羧酸代謝、賴(lài)氨酸降解、血管平滑肌收縮通路等。4.10個(gè)高豐度差異表達(dá)miRNA的組織表達(dá)譜和表達(dá)規(guī)律以及功能分析。利用QRT-PCR的方法，檢測(cè)了10個(gè)miRNA(miR-1，miR-133a-3p，miR-148,miR-206,miR-486,miR-378,m

10、iR-181a/b和miR-103/107)在180日齡巴馬小型豬和長(zhǎng)白豬中的組織表達(dá)譜及它們?cè)谪i出生后5個(gè)不同發(fā)育時(shí)期(Day1、Day30、Day60、Day90和Day180)背最長(zhǎng)肌的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示miR-103/107、miR-148、miR-181a/b在組織中廣泛表達(dá)，miR-1/133和miR-378在肌肉中特異性表達(dá)，miR-486在肌肉中高豐度表達(dá)，miR-206僅在骨骼肌中特異表達(dá);同時(shí)，這些miRNA在背最長(zhǎng)

11、肌中的表達(dá)呈現(xiàn)顯著的日齡和品種差異性。10個(gè)miRNAs(miR181a/b、miR-103/107、miR-206、miR-378、miR-486、miR-499-5p、miR-423-5p和miR-432-5p)功能分析結(jié)果顯示:預(yù)測(cè)的靶基因在肌肉發(fā)育相關(guān)通路、肌肉疾病相關(guān)通路、細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程相關(guān)通路、代謝相關(guān)通路以及神經(jīng)發(fā)育相關(guān)通路5大方面顯著富集。這些結(jié)果提示miRNA在豬肌肉發(fā)育中發(fā)揮重要的作用，可能影響巴馬小型豬和長(zhǎng)白豬之間

12、肌肉生長(zhǎng)和肉質(zhì)性狀的差異。5.豬miR-486宿主基因ANK1在肌肉中新轉(zhuǎn)錄本的鑒定。本研究首次應(yīng)用RACE技術(shù)驗(yàn)證了豬ANK1在39號(hào)內(nèi)含子中存在新的選擇性外顯子1(exon39a)，形成了ANK1短轉(zhuǎn)錄本sANK1基因，提示miR-486可能選擇較近內(nèi)含子作為其啟動(dòng)子。通過(guò)全長(zhǎng)cDNA PCR策略，克隆和分析了轉(zhuǎn)錄本的特征，結(jié)果顯示豬sANK1基因編碼區(qū)存在3種ORF序列，可以形成3種可變剪接體（sANK1-1，sANK1-2和sA

13、NK1-3）。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明豬sANK1的3種可變剪接體是功能比較活躍的蛋白，可能參與信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控等一系列生物過(guò)程。6.miR-486與宿主基因sANK1基因的表達(dá)相關(guān)性分析。豬miR-486與其宿主基因的表達(dá)關(guān)系研究結(jié)果顯示:豬miR-486在DNA和cDNA中均可通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得，且ANK1基因存在正常的外顯子剪切，表明miR-486的初始轉(zhuǎn)錄本與宿主基因ANK1基因的轉(zhuǎn)錄本共表達(dá)。半定量PCR結(jié)果顯示miR-4

14、86在肌肉組織中表達(dá)量最高，sANK1在心肌、背最長(zhǎng)肌和股二頭肌中特異性表達(dá)，說(shuō)明二者在肌肉發(fā)育中均具有重要作用。QRT-PCR結(jié)果顯示miR-486和宿主sANK1基因在豬出生后背最長(zhǎng)肌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中和C2C12細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)均呈相似的上升趨勢(shì)。表達(dá)相關(guān)性分析結(jié)果表明miR-486與sANK1基因在肌肉發(fā)育中的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)，其中，在巴馬小型豬背最長(zhǎng)肌中相關(guān)系數(shù)為r2=0.773(P=0.125);在長(zhǎng)白豬中相關(guān)系數(shù)為r2=0.

15、698(P=0.19);在C2C12成肌細(xì)胞分化過(guò)程相關(guān)系數(shù)為r2=0.999(P＜0.05)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)miR-486與sANK1基因在豬肌肉組織中共享同一個(gè)啟動(dòng)子。7.miR-486/sANK1基因在巴馬小型豬和長(zhǎng)白豬背最長(zhǎng)肌中差異表達(dá)的機(jī)制。QRT-PCR結(jié)果顯示miR-486在1、60、90和180日齡巴馬小型豬中的表達(dá)量高于長(zhǎng)白豬，sANK1基因在60、90、180日齡巴馬小型豬中的表達(dá)量高于長(zhǎng)白豬。為了解析miR-4

16、86/sANK1基因在巴馬小型豬和長(zhǎng)白豬中的表達(dá)差異，克隆豬miR-486/sANK1基因的啟動(dòng)子，并分析啟動(dòng)子區(qū)SNP和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果顯示啟動(dòng)子區(qū)存在18個(gè)SNP位點(diǎn)，其中有14個(gè)SNP位點(diǎn)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的改變。通過(guò)構(gòu)建巴馬小型豬和長(zhǎng)白豬miR-486/sANK1啟動(dòng)子表達(dá)載體pEGFP-BP1、pEGFP-BP2、pEGFP-LP1、pEGFP-LP2，并在不同細(xì)胞中驗(yàn)證了啟動(dòng)子的功能，結(jié)果顯示啟動(dòng)子只在C2C12細(xì)胞

17、中具有較強(qiáng)的啟動(dòng)功能，說(shuō)明啟動(dòng)子具有肌肉特異性;P1片段啟動(dòng)子的活性顯著高于P2片段的活性(P＜0.01);BP1和BP2啟動(dòng)子活性均分別極顯著高于LP1和LP2啟動(dòng)子活性(P＜0.01)，表明巴馬小型豬sANK1啟動(dòng)子活性高于長(zhǎng)白豬。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示巴馬小型豬啟動(dòng)子區(qū)-401位堿基由A突變成G產(chǎn)生了轉(zhuǎn)錄因子MyoD的結(jié)合位點(diǎn)，這可能導(dǎo)致巴馬小型豬與長(zhǎng)白豬sANK1啟動(dòng)子活性的差異，進(jìn)而影響miR-486/sANK1基因的表達(dá)。8.I

18、GF-1-PI3K/AKT-mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因在巴馬小型豬和長(zhǎng)白豬背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)規(guī)律。本實(shí)驗(yàn)克隆了豬p85α(PI3KR1)基因完整的CDS序列，結(jié)果顯示巴馬小型豬p85α基因CDS序列長(zhǎng)2175bp，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)它具有SH3和SH2結(jié)構(gòu)域及與信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的RhoGAP結(jié)構(gòu)域，能夠與IRS1、PTEN、IRS2等蛋白互作。利用QRT-PCR檢測(cè)IGF-1-PI3K/AKT-mTOR信號(hào)通路各基因在巴馬小型豬和長(zhǎng)白豬出生后5

19、個(gè)不同發(fā)育時(shí)期（Day1、Day30、Day60、Day90和Day180）背最長(zhǎng)肌的表達(dá)情況，結(jié)果顯示PTEN、FoxO1和4EBP1基因在兩個(gè)品種各個(gè)日齡中的表達(dá)量均顯著高于其他基因(P＜0.05)，而且，IGF-1-PI3K/AKT-mTOR信號(hào)通路各基因在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)呈現(xiàn)顯著的日齡和品種差異性，這種差異可能是影響巴馬小型豬和長(zhǎng)白豬肌肉性狀差異的原因之一。9.miR-486在IGF-1-PI3K/AKT-mTOR信號(hào)通路中的作

20、用。本研究結(jié)果表明，在正常的生理?xiàng)l件下，miR-486與靶基因IGF-1、p85α、PTEN和FoxO1基因在豬出生后背最長(zhǎng)肌的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。C2C12細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)和抑制miR-486，利用QRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中IGF-1-PI3K/AKT-mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)miR-486抑制了PTEN和FoxO1基因的表達(dá)，同時(shí)INSR、IRS1、AKT1、PDK1、mTOR和4EBP1基因的mR