MiR-1和miR-133在山羊骨骼肌組織和細胞中的表達規(guī)律及功能研究.pdf

1、MicroRNAs(miRNAs)是一組內(nèi)源性非編碼的小RNA分子，由19-22個核苷酸組成，在病毒、動物和植物等生物中廣泛存在。它可以通過與靶基因mRNA的3’端非編碼區(qū)（3’UTR）堿基完全或不完全互補配對，使基因mRNA直接降解或者抑制其翻譯，導致基因在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)生沉默，從而影響基因的表達，進而對細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡、腫瘤的發(fā)生以及脂類代謝等過程進行調(diào)控。目前，關于miRNAs的研究仍處于初步階段，國內(nèi)外的研究主要集中于

2、模式生物miRNAs的發(fā)現(xiàn)，以及其中與生長發(fā)育、疾病發(fā)生相關的miRNAs的功能研究，而對于重要的家畜—山羊的miRNAs的研究則相對較少。本試驗的目的在于通過分析 miR-1和miR-133及其靶基因（HDAC4和 SRF）在山羊骨骼肌的發(fā)育過程和骨骼肌衛(wèi)星細胞中的時空表達規(guī)律以及功能研究，以了解其在山羊骨骼肌發(fā)育過程中的重要作用。
　　1.山羊miR-1和miR-133及其靶基因（HDAC4和SRF）時空表達規(guī)律研究。在影響山

3、羊生長發(fā)育的眾多microRNAs中，選取了兩個重要的microRNAs（miR-1和miR-133）作為研究對象，并利用生物信息學方法篩選miR-1和miR-133在山羊生長發(fā)育過程中可能的靶基因。通過實時定量PCR的方法檢測miR-1和miR-133及其靶基因(HDAC4和SRF)在不同月齡的10個山羊組織（心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、脂肪和背最長?。┲械谋磉_規(guī)律。結果表明：miR-1和 miR-133在安徽白山羊和波爾山羊

4、各組織中差異表達即miR-1和miR-133在心臟和背最長肌組織中的表達量較高，而在其他組織中表達極低。另外，miR-1在山羊骨骼肌組織中的表達量隨著個體成熟表達減少，說明miR-1對肌肉的快速增長極其重要，可以促進肌纖維細胞的大量復制表達，到成體肌細胞增殖和分化都減弱時，表達相對減少。而miR-133隨著個體發(fā)育其表達量顯著增加，到成體時的表達量達到最高，說明成體肌細胞存在增長的現(xiàn)象，且需要miR-133有較高的表達量來促進其增殖。本

5、試驗中miR-1和miR-133在安徽白山羊和波爾山羊中的時空表達規(guī)律，說明miR-1和miR-133與骨骼肌的發(fā)育有密切的聯(lián)系。
　　另外，miR-1和miR-133在波爾山羊和安徽白山羊骨骼肌組織中的表達量差異顯著（P＜0.05）。
　　MiR-1和miR-133的靶基因(HDAC4和SRF)在安徽白山羊和波爾山羊各組織中的表達也存在差異即HDAC4和SRF在心臟和骨骼肌組織中的表達量較低，而在其他組織中的表達量相對較高

6、，這與miR-1和miR-133在安徽白山羊和波爾山羊骨骼肌組織中的表達量是截然相反的。除此之外，HDAC4和SRF在不同月齡的安徽白山羊和波爾山羊的骨骼肌組織中的表達趨勢與miR-1和miR-133類似，這說明miR-1和miR-133的表達量差異會對靶基因的表達產(chǎn)生影響，進一步對動物骨骼肌的生長與發(fā)育產(chǎn)生調(diào)控作用。
　　2. MiR-1和miR-133及其靶基因(HDAC4和SRF)在山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中的表達規(guī)律。通過實時定

7、量 PCR的方法檢測 miR-1和 miR-133及其靶基因(HDAC4和SRF)在F6、F9和F12代山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中的表達規(guī)律。結果表明：miR-1在F6、F9和 F12代山羊骨骼衛(wèi)星細胞中的表達量隨著細胞代數(shù)的增多表達量減少，而miR-133在山羊骨骼衛(wèi)星細胞中的表達量隨細胞代數(shù)的增多表達也隨之增多，這都與其在不同月齡的山羊骨骼肌中的表達趨勢相似。另外，靶基因HDAC4和SRF在F6、F9和F12代山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中的表達趨

8、勢與miR-1和miR-133也是相似的。
　　3. MiR-1和miR-133對靶基因（HDAC4和SRF）的調(diào)控作用。為了提供更有力的證據(jù)來驗證 HDAC4和 SRF基因是否是miR-1和 miR-133的靶基因，本研究將miR-1和miR-133 mimics轉(zhuǎn)染至山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中，然后通過實時定量PCR和Western blotting的方法檢測HDAC4和SRF的mRNA表達水平和蛋白水平。首先利用miRNA neg

9、ative control（發(fā)紅光）進行轉(zhuǎn)染條件的摸索，發(fā)現(xiàn)miRNA negative control的轉(zhuǎn)染濃度為100nM時，轉(zhuǎn)染的效率最高。結果表明，上調(diào)miR-1和miR-133的表達水平對山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞HDAC4和SRF mRNA表達水平無明顯影響，但蛋白水平顯著降低。所以我們初步認為miR-1和miR-133通過抑制山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞HDAC4和SRF基因的翻譯而非誘導HDAC4和SRF mRNA的降解抑制HDAC4和S