miR-2425對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化過程中RAD9A和MyoG基因表達(dá)調(diào)控.pdf

1、骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是肌組織的前體細(xì)胞、可塑性強(qiáng)，具有骨骼肌的許多重要生物特性，肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活、增殖和分化也是骨骼肌細(xì)胞肥大、數(shù)目增多以及肌纖維轉(zhuǎn)化的重要機(jī)制。因此對于肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化過程調(diào)控的研究能夠為肌肉發(fā)育機(jī)制研究提供重要幫助。microRNA(miRNA)是一種非蛋白質(zhì)的新型基因表達(dá)調(diào)控因子，其在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA（～22-nt長）。通過與mRNA配對，miRNA可通過抑制翻譯或刺激mRNA降解來下調(diào)

2、基因表達(dá)。在某些情況下，它們也可以上調(diào)靶基因的表達(dá)。很多miRNA靶基因的表達(dá)對于肌肉的正常發(fā)育具有至關(guān)重要的調(diào)控作用。但是目前對肌肉中miRNA的了解非常有限，很多miRNA調(diào)控肌肉發(fā)育的細(xì)節(jié)仍不是很清楚。因此鑒定新的miRNA并尋找miRNA對肌肉發(fā)育功能基因的研究具有緊迫性。
　　本實驗通過前期對牛骨骼肌分化過程中miRNA高通量深度測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-2425在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(MDSCs-muscle-derived s

3、atellite cells，MDSCs)分化過程中的表達(dá)量呈顯著下降趨勢，推測其在牛MDSCs細(xì)胞分化和肌肉形成過程中具有重要的調(diào)控作用。值得注意的是，miR-2425只在牛中特異性表達(dá)，而未在其他哺乳動物中有所明確。尚無關(guān)于miR-2425生物學(xué)功能的研究報道。所以本實驗以miR-2425為研究對象。實驗材料為原代培養(yǎng)的牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。研究內(nèi)容如下:
　　(1)首先通過Real-time PCR檢測正常生長狀態(tài)下牛MDSC在

4、增殖和分化不同期間miR-2425的表達(dá)變化。實驗結(jié)果顯示:在增殖48 h時，miR-2425表達(dá)量最高，隨著分化的時間的延長，其表達(dá)量呈逐漸降低趨勢。
　　(2)向MDSCs中轉(zhuǎn)染miR-2425模擬物，模擬物對照和miR-2425抑制劑，抑制劑對照。EDU與流式結(jié)果表明，與對照組相比，miR-2425模擬物對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞有促增殖的作用。相反，抑制后，細(xì)胞增殖數(shù)目降低。
　　(3) western blot檢測增殖相關(guān)

5、基因CCNB1、PCNA在蛋白水平的表達(dá)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-2425模擬物后，兩種基因表達(dá)均上調(diào)，抑制后，表達(dá)均下調(diào)。
　　(4)細(xì)胞分化狀態(tài)下通過免疫熒光染色結(jié)蛋白(Desmin)和western Blot檢測肌球蛋白重鏈3(MYH3)分析顯示miR-2425模擬物抑制MDSC分化。而miR-2425抑制劑促進(jìn)MDSC的分化。
　　(5)通過miRbase/Targetscan預(yù)測得出miR-2425調(diào)控的靶基因為MYO

6、G和RAD9A。雙熒光素酶報告，RT-PCR和WB測定顯示，miR-2425直接靶向RAD9同源物A(RAD9A)和肌細(xì)胞生成素(MYOG)的3'UTR區(qū)并負(fù)向調(diào)控它們的表達(dá)。
　　(6)為了進(jìn)一步確定RAD9A抑制MDSC增殖，購買了RAD9A過表達(dá)載體，命名為pcDNA3.1-RAD9A。補(bǔ)充實驗EDU結(jié)果顯示:與對照pcDNA3.1空載體相比，過表達(dá)RAD9A組增殖細(xì)胞的數(shù)量明顯低于對照組?？梢宰C明RAD9A抑制MDSC的增

7、殖。
　　(7) miR-2425是內(nèi)含子miRNA，位于牛NCKAP5L基因的第一個內(nèi)含子中，CrispRi干擾實驗結(jié)果表明干擾宿主基因NCKAP5L轉(zhuǎn)錄后miR-2425表達(dá)也隨著降低，兩者變化規(guī)律一致。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鱩iR-2425無單獨(dú)啟動子，結(jié)合CrispRi干擾實驗，證實miR-2425的表達(dá)受其宿主基因NCK相關(guān)蛋白5(NCKAP5L)的調(diào)控，而不是作為一個獨(dú)立的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄合成。
　　綜上所述，這