Linc-RAM基因表達調(diào)控機制及其在骨骼肌干細胞自我更新與分化中的功能.pdf

1、本文主要從以下幾部分進行探討：
　　第一部分 Linc-RAM基因表達調(diào)控機制及其在骨骼肌干細胞自我更新與分化中的功能
　　骨骼肌干細胞，也被稱為肌衛(wèi)星細胞(Satellite cells，SCs)，是位于成體骨骼肌組織的肌纖維膜和基底膜之間保持干性的單核細胞，在骨骼肌生長發(fā)育及出生后骨骼肌損傷—再生過程中發(fā)揮重要作用。正常情況下，骨骼肌成體干細胞處于靜息狀態(tài)，當受到外界刺激或損傷時，靜息的骨骼肌干細胞被激活、增殖、分化參與

2、修復損傷的肌纖維，同時少部分群體進行自我更新維持干細胞庫的穩(wěn)態(tài)并長期保持損傷再生的潛能。骨骼肌成體干細胞自我更新或分化異常是許多肌肉相關(guān)疾病的致病因素之一，如肌營養(yǎng)不良患者的骨骼肌成體干細胞存在嚴重的自我更新與分化缺陷。
　　近年來，人們對骨骼肌成體干細胞自我更新與分化調(diào)控機制的研究逐漸深入，并鑒定出多種參與調(diào)節(jié)SCs的自我更新與分化的調(diào)控因子。例如，廣泛用于SCs體外培養(yǎng)的FGF2，盡管有研究表明FGF2通過抑制MyoD的轉(zhuǎn)錄調(diào)

3、節(jié)骨骼肌干細胞自我更新、抑制干細胞分化，但我們對FGF2信號通路調(diào)控干細胞自我更新過程中涉及的下游靶基因仍然知之甚少。
　　長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度大于200 nt不編碼蛋白的RNA，在細胞命運決定、增殖、分化、凋亡和衰老過程中發(fā)揮重要的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)一些lncRNAs參與調(diào)控骨骼肌發(fā)育、骨骼肌細胞的增殖和分化。LincRNA Activator ofMyogenesi

4、s(Linc-RAM)是我們實驗室首先發(fā)現(xiàn)和鑒定到的受MyoD調(diào)節(jié)，在骨骼肌細胞譜系特異表達的基因間區(qū)長非編碼RNA。Linc-RAM基因通過促進MyoD/Baf60c/Brg1復合物的組裝增強骨骼肌細胞分化。敲除小鼠的研究表明，Linc-RAM影響骨骼肌發(fā)育與再生。然而，目前對Linc-RAM在骨骼肌細胞中表達調(diào)控的分子機制以及Linc-RAM是否參與骨骼肌成體干細胞的自我更新與分化過程還不清楚。
　　本研究的核心科學問題是Li

5、nc-RAM基因的自身表達調(diào)控機制及其在骨骼肌成體干細胞自我更新與分化中的功能。我們的結(jié)果表明:在骨骼肌細胞中，Linc-RAM基因的表達受到FGF2信號通路調(diào)節(jié)，并在介導FGF2調(diào)控骨骼肌干細胞自我更新和分化的功能上發(fā)揮重要作用。實驗室已有數(shù)據(jù)證明Linc-RAM基因表達受到FGF2/Ras/Raf/Mek/Erk1/2信號通路的負性調(diào)節(jié)。我們的結(jié)果進一步證明，在C2C12細胞中過表達MyoD能夠拯救FGF2對Linc-RAM基因表達

6、的抑制，同時從MyoD-/-;Pax7-nGFP小鼠分離骨骼肌干細胞研究發(fā)現(xiàn)，敲除MyoD基因后消除FGF2對Linc-RAM基因表達的抑制作用，由此說明成肌細胞轉(zhuǎn)錄因子MyoD在FGF2對Linc-RAM基因調(diào)節(jié)的過程中發(fā)揮重要作用。功能研究發(fā)現(xiàn)，在C2C12細胞中過表達Linc-RAM能夠拯救FGF2對肌細胞分化的抑制，從Linc-RAM基因敲除的小鼠(Linc-RAM-/-;P ax7-nGFP)中分離骨骼肌干細胞，對其增殖和分化

7、能力檢測發(fā)現(xiàn)，Linc-RAM敲除后骨骼肌干細胞的分化能力減弱，而增殖能力增強。分離Linc-RAM基因敲除小鼠的單根肌纖維進行體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，Linc-RAM基因敲除后骨骼肌干細胞的分化能力減弱，自我更新能力增強。在人類DMD疾病模型Mdx小鼠中敲除Linc-RAM可以顯著地改善Mdx小鼠的病理表型。
　　綜上所述，本研究揭示了骨骼肌特異性表達的長非編碼Linc-RAM基因受FGF2信號通路負性調(diào)節(jié)的分子機制，并介導FGF2調(diào)節(jié)骨

8、骼肌干細胞自我更新與分化功能，從而為長非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供可靠依據(jù)，為Linc-RAM基因?qū)崿F(xiàn)骨骼肌干細胞應(yīng)用與臨床治療方面提供理論基礎(chǔ)。
　　第二部分 miR-30e在骨骼肌中受myostatin負性調(diào)節(jié)參與肌纖維類型形成
　　Myostatin(MSTN)通過調(diào)節(jié)microRNAs(miRNA)負性調(diào)節(jié)肌細胞增殖分化。最近，我們以MSTN敲除(MSTN-/-)小鼠為模型，對骨骼肌進行miRNA微矩陣分析發(fā)現(xiàn)mi

9、R-431受MSTN信號通路調(diào)節(jié)。為進一步鑒定其他受MSTN調(diào)節(jié)的miRNAs，我們重新分析了這些miRNA芯片，并用RT-PCR方法進行驗證。最終，我們發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，MSTN-/-小鼠骨骼肌中miR-30e顯著上調(diào)。重要的是，miR-30e的預測靶基因能夠參與肌細胞分化和肌纖維形成。利用熒光素酶報告基因法，我們進一步證明過氧化物酶增殖因子活化受體γ共激活子1α(Pgc1α)是miR-30e的直接靶基因。在C2C12中過表達mi