長非編碼RNA--AK394747在豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖及分化過程中的作用研究.pdf

1、骨骼肌衛(wèi)星細胞是一類位于肌纖維膜表面與基底膜之間的細胞，在肌肉的發(fā)育和再生過程中發(fā)揮著重要的作用。長非編碼RNA(Long non coding RNAs，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt，具有低蛋白編碼潛力的RNA分子。lncRNA能夠調(diào)控基因表達、參與表觀遺傳修飾，影響細胞增殖、分化和凋亡等多種生命活動的進程。本研究以體外分離的豬骨骼肌衛(wèi)星細胞為材料，研究一個新的lncRNA-AK394747在細胞增殖和分化過程發(fā)揮的功

2、能及可能存在的機制。主要研究結(jié)果如下:
　　1.利用兩步酶消化法成功分離出活性較高、有一定增殖能力的豬原代骨髂肌衛(wèi)星細胞，經(jīng)差速貼壁純化后，用Pax7基因?qū)Ψ蛛x的細胞進行鑒定，免疫熒光結(jié)果顯示細胞陽性率高達95％。同時，對分離的細胞進行分化誘導培養(yǎng)，能形成肌管，且穩(wěn)定表達MyoD、MyoG和MyHc這三個成肌標志基因。
　　2.通過RACE和測序驗證了豬AK394747全長為1586bp，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)該lncRNA不具

3、有編碼蛋白的能力，主要存在于細胞質(zhì)中，時空表達譜分析表明AK394747在腿肌、背肌等肌肉組織中高表達，且隨著豬骨骼肌細胞的分化表達量上升。
　　3.在豬骨骼肌細胞中利用干擾和超表達實驗研究了AK394747對細胞增殖和分化的影響，EdU、RTCA以及細胞周期檢測等實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)該lncRNA對骨骼肌細胞的增殖過程無顯著影響，并且增殖相關(guān)基因ki67、N-Ras和CDK家族基因表達變化不顯著;而干擾AK394747后，利用Q-PCR

4、、Westren Blotting以及免疫熒光技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)肌細胞分化標志基因MyoD、myoG、MyHc等的mRNA和蛋白水平表達顯著下降，表明AK394747促進了豬骨骼肌細胞分化。
　　4通過生物信息學篩選了4個潛在的與AK394747結(jié)合的miRNA—ssc-miR-32，ssc-miR-218，ssc-miR-218-3p，ssc-miR-301。在干擾AK394747后，其中ssc-miR-32及其pri-RNA表達降低