1、GEP蛋白在骨骼肌分化過程中的功能研究;2、ADAMTS-12抑制軟骨分化的功能研究.pdf

1、GEP（granulin-epithelin precursor）蛋白是一種自分泌生長因子，也被稱為progranulin，proepithelin，acrogranin或者PC細胞衍生生長因子，是一個68．5-kDa大小的分泌性生長因子。它的序列高度保守，幾乎在所有真核生物中均表達。該蛋白高度糖基化，在SDS-PAGE上呈現(xiàn)為分子量大小約90-kDa。結(jié)構上，它屬于生長因子家族。GEP可以以完整蛋白形式分泌，或者被蛋白水解，以多肽的形

2、式分泌，即組成GEP蛋白的多肽片段-顆粒體蛋白（granulin）。GEP蛋白作為一種具有較大分子量的自分泌生長因子，參與多種生理性和病理性過程。GEP蛋白在代謝較快的上皮細胞，免疫系統(tǒng)的各種細胞和神經(jīng)細胞中豐富表達。同時，在人類幾種癌組織中也有報道GEP蛋白高度表達，有理由相信，GEP蛋白會導致乳腺癌，透明細胞腎癌，侵襲性卵巢癌，成膠質(zhì)細胞瘤，脂肪畸胎瘤，多發(fā)性骨髓瘤和骨肉瘤。同時，越來越多的證據(jù)表明GEP蛋白也參與分化、發(fā)育和病理過

3、程中的調(diào)節(jié)。 本文主要研究GEP蛋白在骨骼肌分化中的作用和機制。骨骼肌分化過程是受一些轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的（成肌因子家族），包括MyoD，Myf5，myogenin和MRF4。成肌因子在肌分化過程中起著重要的作用，如果在任何非成肌細胞（例如10T1/2成纖維細胞）中異位表達這些成肌因子，將會導致多種肌分化基因的表達，促使其向肌管分化。本研究以GEP蛋白為主要研究對象，系統(tǒng)的探討了GEP蛋白在成肌細胞分化中的調(diào)節(jié)作用及機制，首次揭示了

4、GEP蛋白在成肌細胞分化中的調(diào)節(jié)作用及其相應的分子機制： 1．我們利用免疫組織化學染色的方法，顯示GEP蛋白在胚胎肌肉組織中表達，應用細胞免疫熒光和實時熒光定量PCR方法，證明GEP在C2C12細胞向肌管分化過程中，GEP表達量是增高的，無論是mRNA水平還是蛋白水平。提示GEP在調(diào)節(jié)骨骼肌分化中起作用。 2．應用細胞免疫熒光和實時熒光定量PCR方法，證明MyoD可以誘導內(nèi)源性GEP的表達，無論在轉(zhuǎn)錄水平還是蛋白水平都增

5、加。 3．通過對GEP基因核酸序列的分析，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)有5個潛在的MyoD結(jié)合位點，我們使用了4個GEP特異性報告基因質(zhì)粒，含有不同數(shù)量的MyoD結(jié)合位點，共轉(zhuǎn)染上述報告基因與MyoD的真核表達質(zhì)粒，通過檢測熒光素酶表達活性研究MyoD對于GEP表達的影響。結(jié)果顯示，MyoD可以激活GEP特異報告基因，MyoD在成肌細胞分化過程中具有調(diào)節(jié)GEP轉(zhuǎn)錄的功能。 4．應用點突變技術，我們在報告基因271GEP-luc中GE

6、P的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)引入了MyoD結(jié)合位點的點突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MyoD失去激活作用，同時應用凝膠電泳遷移實驗及染色質(zhì)免疫共沉淀，證明在成肌細胞分化過程中MyoD對GEP基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用通過MyoD直接結(jié)合到GEP基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的MyoD結(jié)合位點上實現(xiàn)。 5．我們研究了GEP過表達與低水平對成骨細胞分化的影響。結(jié)果顯示，在成肌細胞分化過程中，高水平GEP能夠抑制成肌細胞的分化，而在低GEP的細胞環(huán)境中，分化被促進了。 6．為了揭

7、示GEP抑制骨骼肌分化的分子機制，我們進一步研究了GEP在肌分化過程中，對成肌因子家族的作用。實驗證明GEP在成肌細胞分化過程中抑制MyoD、Myf5、Myogenin、MHC基因的表達。 7．JunB可以抑制骨骼肌分化。我們在肌分化的早期，應用實時熒光定量PCR，免疫印跡和細胞免疫熒光檢測GEP對JunB表達的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)GEP誘導JunB的表達。成功構建JunB表達質(zhì)粒及JunB siRNA質(zhì)粒，通過檢測熒光素酶表達活性及MH