ADAMTS-7和ADAMTS-12抑制軟骨分化的功能研究.pdf

1、金屬蛋白酶ADAMTS-7和ADAMTS-12同屬于ADAMTS家族（含TSP結(jié)構(gòu)的去整合素金屬蛋白酶，a disintegrin and metalloprotease with thromospondin motifs，ADAMTS），其對降解軟骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和關(guān)節(jié)炎具有非常重要的作用。ADAMTS家族含有分泌性鋅指蛋白，并且有較嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆肿咏Y(jié)構(gòu)，至少包括一個(gè)thrombospondin motif重復(fù)結(jié)構(gòu)。這個(gè)家族具有重要的功能，

2、ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5、ADAMTS-8、ADAMTS-9、ADAMTS-16和ADAMTS-18可以降解多聚蛋白糖，ADAMTS-5在小鼠關(guān)節(jié)炎模型中蛋白多聚糖的丟失上起著重要的作用。ADAMTS-7和ADAMTS-12具有相同的結(jié)構(gòu)域組成，構(gòu)成ADAMTS家族的亞型。我們最初報(bào)道ADAMTS-7和ADAMTS-12直接結(jié)合并降解軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（cartilage oligomeric matrix p

3、rotein，COMP），一種軟骨最主要的非膠原組成物。另外，我們研究發(fā)現(xiàn)α-2-巨球蛋白可以抑制COMP蛋白的降解。最近還有研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS-12也能夠降解軟骨聚集蛋白多糖。 本文的研究發(fā)現(xiàn)，在軟骨分化過程中ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達(dá)量都顯著增高，意味著在骨骼發(fā)育中ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達(dá)量在時(shí)間、空間上都有變化。我們的研究重點(diǎn)關(guān)注．ADAMTS-7和ADAMTS-12在軟骨分化中的作用，

4、以及涉及到的分子機(jī)制。我們研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS-7和ADAMTS-12蛋白在軟骨分化中被誘導(dǎo)表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果揭示在體外軟骨分化的第5天，這兩種蛋白的表達(dá)量還較低，但從第7天開始，他們的量成三倍增長，并在分化后期一直維持此高表達(dá)狀態(tài)。本文中，我們首次發(fā)現(xiàn)ADAMTS-7和ADAMTS-12都能夠抑制軟骨細(xì)胞的分化及軟骨成骨。 我們研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS-7對軟骨細(xì)胞的分化及軟骨成骨的抑制功能是依賴于ADAMTS-7的蛋白

5、酶活性的。ADAMTS-7的cysteine-rich結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏DAMTS-7與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用和細(xì)胞膜表面定位是必不可少的，C-末端的4個(gè)thromospondin motif結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏DAMTS-7的蛋白水解酶活性和抑制軟骨細(xì)胞分化功能也是必需的。因此，ADAMTS-7對于軟骨細(xì)胞分化和軟骨成骨，是一個(gè)潛在的負(fù)調(diào)控因子，這種抑制功能嚴(yán)格地依賴于ADAMTS-7的酶切活性。而當(dāng)ADAMTS-7發(fā)生點(diǎn)突變后，則完全喪失了酶切活性，

6、同時(shí)也喪失了對軟骨細(xì)胞的抑制作用。ADAMTS-7由多個(gè)功能性亞基構(gòu)成，包括一個(gè)鋅離子催化結(jié)構(gòu)域和其他幾個(gè)非催化結(jié)構(gòu)域，包括：1個(gè)disintegrin結(jié)構(gòu)域、1個(gè)thrombospondin結(jié)構(gòu)域、1個(gè)cysteine-rich結(jié)構(gòu)域（CRD）、1個(gè)spacer-1結(jié)構(gòu)域、3個(gè)thrombospondin motifs、1個(gè)spacer-2結(jié)構(gòu)域和C-末端4個(gè)thrombospondin motifs。研究發(fā)現(xiàn)C-末端的4個(gè)throm

7、bospondin motifs具有結(jié)合底物的功能，如結(jié)合COMP，而ADAMTS-7的其他功能結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)功能卻還都不清楚。為了揭示各個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能，我們構(gòu)建了一系列的ADAMTS-7的C-末端缺失突變體，發(fā)現(xiàn)ADAMTS-7的cysteine-rich結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏DAMTS-7與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)相互作用和細(xì)胞膜表面定位是必不可少的。然而有趣的是，ADAMTS-7及一系列C-末端缺失突變體蛋白在Cos-7細(xì)胞中的檢測結(jié)果顯示，cyst

8、eine-rich結(jié)構(gòu)域?qū)DAMTS-7蛋白定位的影響，是有細(xì)胞類型特異性的。另外，ADAMTS-7的酶切活性同樣也受到非催化亞基的調(diào)控，尤其是C-末端的4個(gè)thrombospondin motifs和抑制性spacer-2結(jié)構(gòu)域。 ADAMTS-7和ADAMTS-12是PTHrP重要的靶分子，原因如下：（1）PTHrP誘導(dǎo)ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達(dá)，（2）在PTHrP基因敲除小鼠的軟骨生長板上幾乎檢測不到A

9、DAMTS-7和ADAMTS-12的表達(dá)，（3）沉默ADAMTS-7/ADAMTS-12或用特異性抗體封閉ADAMTS-7/ADAMTS-12的活性，則幾乎阻斷了PTHrP介導(dǎo)的抑制軟骨細(xì)胞肥大化和軟骨成骨的生長。研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS-7和一個(gè)新的軟骨生長因子GEP（Granulin-epithelin precursor）相互作用。骨骺生長板內(nèi)的軟骨內(nèi)骨化過程，涉及多個(gè)信號傳導(dǎo)途徑。我們的研究證明：1）過表達(dá)ADAMTS-7和ADAM

10、TS-12誘導(dǎo)PTHrP，抑制IHH：2）在體外軟骨分化過程中，PTHrP促進(jìn)ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達(dá)；3）在小鼠生長板軟骨細(xì)胞中，ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達(dá)依賴于PTHrP信號途徑。這些研究結(jié)果揭示在軟骨分化過程中，ADAMTS-7、ADAMTS-12和PTHrP信號途徑之間存在一個(gè)正反饋通路。另外，ADAMTS-7、ADAMTS-12是PTHrP的下游靶分子，基于以下原因：1）PTHrP抑制軟骨分化

11、過程中Col X的表達(dá)，然而當(dāng)通過特異性干擾RNA抑制．ADAMTS-7/ADAMTS-12或用抗ADAMTS-7/ADAMTS-12的抗體封閉后，PTHrP的抑制作用則消失了；再次表達(dá)ADAMTS-7/ADAMTS-12，則PTHrP的抑制作用又重新回復(fù)；2）ADAMTS-7/ADAMTS-12抗體的封閉，則完全中和了PTHrP所抑制的軟骨細(xì)胞肥大化、礦化和骨生長。另外，研究發(fā)現(xiàn)PTHrP促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，ADAMTS-7發(fā)現(xiàn)也具有

12、促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的功能，而且此促細(xì)胞增殖作用主要依賴于C-末端的4個(gè)thrombospondin motifs結(jié)構(gòu)域。 另外ADAMTS-7可以作為GEP-轉(zhuǎn)化酶，抵消GEP刺激誘導(dǎo)的軟骨分化及軟骨內(nèi)成骨?？傊?，我們的試驗(yàn)結(jié)果證明，ADAMTS-7是PTHrP信號途徑下游的非常重要的靶分子，負(fù)調(diào)控軟骨內(nèi)成骨過程；直接結(jié)合、轉(zhuǎn)化GEP，從而失活軟骨分化生長因子GEP的誘導(dǎo)分化作用。GEP是一種生長因子，參與組織重生、腫瘤形成和炎癥

13、過程。研究發(fā)現(xiàn)GEP與彈性蛋白酶結(jié)合，被彈性蛋白酶降解。彈性蛋白酶消化GEP的顆粒內(nèi)連接子，產(chǎn)生微粒多肽；然而分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制因子（secretory leukocyte protease inhibitor，SLPI）直接結(jié)合到彈性蛋白酶或抑制顆粒多肽與蛋白酶的結(jié)合，繼而封閉彈性蛋白酶的活性。最近研究揭示蛋白酶3也結(jié)合并降解GEP；蛋白酶3和彈性蛋白酶都通過降解抗炎癥作用的GEP，從而達(dá)到促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞依賴性的致炎癥功能。本文

14、中，我們提供了足夠的試驗(yàn)證據(jù)表明GEP和金屬蛋白酶ADAMTS-7在軟骨細(xì)胞內(nèi)相互作用，ADAMTS-7可以將GEP轉(zhuǎn)化為小分子片段；另外，GEP能具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化和軟骨成骨，而ADAMTS-7很可能是通過失活GEP的活性而抑制軟骨分化及軟骨成骨的。我們以往研究發(fā)現(xiàn)：1）ADAMTS-7結(jié)合并降解COMP，2）COMP和GEP相互作用，促進(jìn)GEP刺激的軟骨分化功能。結(jié)合現(xiàn)在我們的結(jié)果ADAMTS-7和GEP相互作用，我們發(fā)現(xiàn)ADAM

15、TS-7、GEP和COMP形成一個(gè)調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞功能的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)。然而ADAMTS-7、生長因子GEP和細(xì)胞外基質(zhì)COMP之間是如何相互作用，如何調(diào)控軟骨細(xì)胞分化和軟骨成骨的。 本文研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS-7和ADAMTS-12是PTHrP調(diào)控通路中的新調(diào)控因子，同時(shí)也可調(diào)控軟骨細(xì)胞分化和軟骨內(nèi)成骨。本文對ADAMTS-7、ADAMTS-12負(fù)調(diào)節(jié)軟骨分化的機(jī)制進(jìn)行了初步探討，例如金屬蛋白酶ADAMTS-7和促軟骨分化