VWF和ADAMTS13相互作用機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分血管性血友病因子裂解蛋白酶的真核穩(wěn)定表達(dá)及其活性檢測
　　目的：本研究旨在得到重組的血管性血友病因子裂解蛋白酶（ADAMTS13），進(jìn)一步研究其在血栓止血中的作用。
　　方法：利用脂質(zhì)體將編碼ADAMTS13全長序列的重組質(zhì)粒pSecTag-ADAMTS13轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，用潮霉素（hygromycin-B）篩選得到陽性克隆細(xì)胞株，并擴(kuò)大培養(yǎng)，收集上清。利用Ni-NTA瓊脂糖柱，梯度咪唑淋洗法純化蛋白，SDS-PA

2、GE和Western blotting鑒定純化產(chǎn)品純度和免疫學(xué)活性，采用GST-His雙抗夾心法測定蛋白剪切活性。
　　結(jié)果：成功獲得一株能恒定分泌重組ADAMTS13蛋白的細(xì)胞株ADAMTS2-4，每1 L培養(yǎng)上清可純化到5.8 mg重組蛋白。Western blotting結(jié)果顯示，ADAMTS13多抗能與重組蛋白在190 kDa處顯單一條帶，并且蛋白具有6.4 U/mL的剪切活性（每mL正常人混合血漿中ADAMTS13活性為

3、1U）。
　　結(jié)論：重組蛋白具有較好的免疫原活性和酶活性，為進(jìn)一步研究ADAMTS13作用機(jī)理和運(yùn)用奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　第二部分2B/2M型VWD的A1區(qū)突變聯(lián)合血小板膜糖蛋白GPIbα影響ADAMTS13水解VWF的功能研究
　　目的：血漿中，血管性血友病因子（VWF）多聚體分子大小由金屬蛋白酶ADAMTS13特異性調(diào)節(jié)。血小板膜糖蛋白（GP）Iα重組片段結(jié)合 VWF的A1區(qū)后可以增強(qiáng)ADAMTS13水解VWF的

4、能力。而2B型和2M型血管性血友?。╒WD）分別是由于GPIα與VWF親和力增強(qiáng)或減弱而引起出血異常的。然而，2B/2M型VWD在A1區(qū)的突變與GPIα對ADAMTS13水解VWF的影響仍需作進(jìn)一步的研究。
　　方法：真核表達(dá)了不同類型的全長人重組VWF（rVWF），包括3個(gè)2B型突變（P1337L，H1268D，R1308C）、1個(gè)2M型突變（D1302G）和野生型（WT）。3種類型的rVWF經(jīng)多聚體分析、瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板

5、聚集（RIPA）和 VWF輔因子實(shí)驗(yàn)（VWF:RCo-ELISA）鑒定。經(jīng)鑒定后的rVWF在靜止或高剪切力條件（GPIα活性片段存在或不存在）被ADAMTS13水解。
　　結(jié)果：靜止（非變性）或高剪切力條件，相較于野生型2B型突變體表現(xiàn)出對ADAMTS13更高的敏感性，而2M型突變體無明顯差別。在靜止（變性）或高剪切力（存在GPIα活性片段）條件下，野生型rVWF表現(xiàn)出甚至高過2個(gè)2B型突變體對ADAMTS13的敏感性。
　

6、　結(jié)論：位于 A1區(qū)2B型突變通過對VWF自身構(gòu)象的改變，能增強(qiáng)VWF對ADAMTS13結(jié)合從而提高敏感性。當(dāng)GPIα參與時(shí)，野生型rVWF對ADAMTS13的敏感性急劇增加，而一些2B型突變卻增加不明顯。
　　第三部分 ADAMTS13單克隆抗體的鑒定以及生物學(xué)功能的研究
　　目的：血漿金屬蛋白酶ADAMTS13通過水解VWF調(diào)節(jié)分子大小，是血小板的聚集和初期止血的關(guān)鍵分子蛋白。ADAMTS13-VWF軸的生理重要性主要體

7、現(xiàn)在遺傳或獲得性ADAMTS13的缺失相關(guān)的血栓性血小板減少性紫癜（TTP）。制備鼠源性的抗人ADAMTS13的單抗對于研究ADAMTS13的功能至關(guān)重要。
　　方法：利用真核表達(dá)的重組ADAMTS13截短型蛋白（ADAMTS13-T7）純品免疫Balb/c小鼠，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體技術(shù)制備單抗。用 ELISA方法鑒定單抗的特異性，利用免疫印跡技術(shù)確定單抗與全長 ADAMTS13的識(shí)別能力。功能實(shí)驗(yàn)方面，觀察單抗對ADAMTS13水解

8、VWF的影響。
　　結(jié)果：最終獲得6株抗ADAMTS13的單抗，克隆號(hào)分別為1G11、2F11、6G3、9E1、10A2、10B4。經(jīng)ELISA鑒定，純化后的單抗1G11和2F11的效價(jià)最高，另外與截短型ADAMTS13-T7蛋白結(jié)合能力明顯高于全長ADAMTS13蛋白。Western blotting結(jié)果顯示，6個(gè)單抗都能與全長ADAMTS13結(jié)合，1G11和2F11條帶最亮。另外，在功能實(shí)驗(yàn)中，變性條件下，1G11和2F11能