RANKL-NFκB-ADAMTS5信號(hào)軸調(diào)控軟骨退變的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　明確核因子κ B受體活化因子配體(Receptor Activator for NuclearFactor-κ B Ligand，RANKL)對(duì)軟骨的直接作用及作用機(jī)制，為關(guān)節(jié)軟骨退變的治療提供新思路。
　　方法:
　　體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)選用軟骨細(xì)胞株ATDC5，以明確RANKL對(duì)軟骨細(xì)胞的直接作用。體外培養(yǎng)采用牛軟骨片，以明確RANKL對(duì)軟骨組織的直接作用。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用C57BL/6J小鼠，以明確RANKL

2、在體內(nèi)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的作用。
　　第一部分:RT-PCR檢測(cè)正常軟骨細(xì)胞中核因子κ B受體活化因子(ReceptorActivator for Nuclear Factor-κ B，RANK)和RANKL的表達(dá)，RT-qPCR檢測(cè)軟骨細(xì)胞ATDC5在分化過(guò)程中Col2a1、Col10a、OPG、SOX9、RANK和RANKL的時(shí)空表達(dá)，Western蛋白印跡檢測(cè)RANKL刺激后ATDC5細(xì)胞中RANK的表達(dá)變化，H&E、Alcian

3、Blue和Safranin0染色及Markin評(píng)分分析RANKL刺激對(duì)軟骨細(xì)胞或組織的直接作用。
　　第二部分: RT-qPCR檢測(cè)RANKL刺激后ATDC5細(xì)胞Col2a1、MMP9、MMP13、ADAMTS5的時(shí)空表達(dá)變化，Western蛋白印跡檢測(cè)RANKL刺激后MMP13、ADAMTS5的時(shí)空表達(dá)變化，不同濃度的RANKL刺激對(duì)ADAMTS5表達(dá)的影響，及RANKL刺激0～120分鐘內(nèi)總IKB-α和磷酸化的IKB-α的表達(dá)

4、變化。免疫熒光和激光共聚焦觀察p65的入核情況。IKB-α特異性抑制劑選用BAY11-7082。RANK沉默選用小干擾RNA。
　　第三部分:Micro-CT檢測(cè)關(guān)節(jié)腔RANKL后脛骨骨體積分?jǐn)?shù)的變化，RT-qPCR檢測(cè)股骨TRAP、Col2a1和Col10a的表達(dá)情況，H&E染色分析關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)變化情況，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Col2a1、Col10a、MMP9、MMP13、OPG、RANKL和ADAMTS5等蛋白的表達(dá)變化。采

5、用SPSS17.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1)軟骨細(xì)胞可以表達(dá)RANK及RANKL。在軟骨分化過(guò)程中，RANKL和RANK的表達(dá)隨時(shí)間增多。外源性RANKL刺激可以使軟骨細(xì)胞的RANK表達(dá)上調(diào)。外源性的RANKL刺激可導(dǎo)致軟骨結(jié)構(gòu)紊亂，蛋白多糖丟失，Markin評(píng)分升高(P＜0.05)
　　2)相對(duì)于對(duì)照組，RANKL刺激ATDC5細(xì)胞后，與軟骨退變相關(guān)的MMP9、MMP13和ADAMTS5的表達(dá)

6、顯著升高，且有濃度依賴性;而軟骨標(biāo)志因子Ⅱ型膠原和X型膠原的mRNA水平顯著下降(P＜0.05)。RANKL刺激后細(xì)胞中總IKB-α的表達(dá)隨時(shí)間表達(dá)下降，磷酸化IKB-α開始隨時(shí)間表達(dá)增多，在30min表達(dá)達(dá)到峰值，隨后下降。免疫熒光染色后，激光共聚焦觀察到p65在30min時(shí)有明顯的入核。加入IKB-α特異性抑制劑BAY11-7082后，再次加入RANKL刺激ADAMTS5的表達(dá)增量隨著抑制劑濃度增加而下降。RANK沉默后，ADAMT

7、S5的上調(diào)也不再觀察到。
　　3)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射RANKL可以引起骨體積分?jǐn)?shù)下降、Col2a1和Col10a的表達(dá)下降及TRAP的表達(dá)升高。H&E染色顯示軟骨層空泡的出現(xiàn)及軟骨細(xì)胞數(shù)目的減少。免疫組織化學(xué)染色顯示，與軟骨標(biāo)志蛋白Col2a、Col10a的表達(dá)下降，而與軟骨退化相關(guān)的ADAMTS5、MMP9、MMP13表達(dá)升高。與此同時(shí)，RANKL表達(dá)升高，而OPG的表達(dá)下降。
　　結(jié)論:
　　RANKL可以通過(guò)NFκ B