軟骨分化過程中的microRNA的功能研究.pdf

1、骨質(zhì)性關(guān)節(jié)炎是人群中高發(fā)的骨骼疾病，其表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨的降解和結(jié)構(gòu)的破壞。關(guān)節(jié)軟骨與胚胎發(fā)育過程中的軟骨細(xì)胞是同一來源的，都是由間質(zhì)祖細(xì)胞聚集分化而來。隨著 microRNA在脊椎動(dòng)物發(fā)育中的作用被發(fā)現(xiàn)與報(bào)道，在軟骨化過程中的相關(guān) microRNA研究成為了骨骼發(fā)育與骨關(guān)節(jié)炎病理研究的新一熱點(diǎn)。近年來，已有關(guān)于軟骨分化過程中的相關(guān)microRNA研究報(bào)道，但對(duì)軟骨分化和關(guān)節(jié)炎病理發(fā)生中特異性調(diào)控的microRNA了解仍然并不充分。本文旨在

2、通過對(duì)軟骨分化過程的microRNA差異化芯片分析尋找該過程中特異調(diào)控的功能性microRNA，并探究其在軟骨發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制與功能。
　　本文實(shí)驗(yàn)通過體外原代培養(yǎng)鼠 E12.5肢芽細(xì)胞，對(duì)其軟骨化過程與Wnt/β-catenin信號(hào)誘導(dǎo)的非軟骨化過程進(jìn)行差異化對(duì)比芯片分析，發(fā)現(xiàn)了miR-140、miR-140*、miR-455在軟骨分化過程中特異表達(dá)；miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-206肌肉相關(guān)的mic

3、roRNA在Wnt/β-catenin信號(hào)誘導(dǎo)作用下高量表達(dá)。隨后，通過 RT-PCR、RACE、原位雜交等實(shí)驗(yàn)，本文發(fā)現(xiàn)miR-140，miR-140*的初始轉(zhuǎn)錄本通過內(nèi)含子保留形式特異在軟骨發(fā)生過程中表達(dá)，并與其宿主基因Wwp2-C共表達(dá)。Wwp2-C基因在軟骨中的特異性表達(dá)以及蛋白編碼能力在本文中首次被報(bào)道與驗(yàn)證。為了探求miR-140/140*表達(dá)的特異性，本文通過對(duì)克隆的miR-140/140*初始轉(zhuǎn)錄本的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行熒光素

4、酶激活實(shí)驗(yàn)以及與軟骨特異性轉(zhuǎn)錄因子 Sox9的ChIP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) Sox9通過與-200bp堿基位點(diǎn)的直接結(jié)合激活了miR-140在軟骨發(fā)生中特異表達(dá)。接著，本文進(jìn)一步在軟骨發(fā)生中探究miR-140的功能，利用RCAS::miR-140-Sponge病毒在雞胚肢芽細(xì)胞中特異性抑制miR-140在軟骨發(fā)生中的功能，發(fā)現(xiàn)miR-140對(duì)于維持軟骨發(fā)生過程中的細(xì)胞增殖過程是必須的。結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)以及分子生物學(xué)驗(yàn)證，本文發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期調(diào)控基因

5、Sp1是miR-140在軟骨發(fā)生過程中的一個(gè)靶基因。
　　綜上所述，本文通過對(duì)軟骨發(fā)生過程與Wnt誘導(dǎo)的非軟骨化過程的microRNA差異對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)miR-140特異表達(dá)于軟骨發(fā)生中，它與宿主基因Wwp2-C共表達(dá)并受到轉(zhuǎn)錄因子Sox9的直接誘導(dǎo)，在軟骨發(fā)生中它通過對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白 Sp1的直接靶向作用維持軟骨細(xì)胞增殖。以上研究拓展了軟骨發(fā)生過程中的microRNA功能研究，為microRNA在骨骼發(fā)育過程中的作用提供了新的機(jī)