MicroRNA‐145在間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、軟骨缺損一直是外科修復(fù)治療的難題，組織工程學(xué)能夠結(jié)合細(xì)胞學(xué)和工程學(xué)原理對(duì)受損組織進(jìn)行生理性修復(fù)，是一種理想的修復(fù)方法。由于其自身優(yōu)勢(shì)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymAlstem cells，MSCs)被認(rèn)為是目前軟骨組織工程較理想的種子細(xì)胞，如何調(diào)控MSCs 定向分化成軟骨細(xì)胞是目前軟骨組織工程學(xué)中的重要問題。然而，MSCs 成軟骨分化的精確分子調(diào)控機(jī)制還未完全闡明，因此探求MSCs 成軟骨分化的調(diào)控機(jī)制，有可能為探索切實(shí)有效的促

2、分化策略提供基礎(chǔ)，同時(shí)也有益于推進(jìn)組織工程軟骨在臨床的應(yīng)用前景。近年一些研究證實(shí)，microRNA(miRNAs)在干細(xì)胞的干性維持和分化中具有重要的功能。與越來越復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)和蛋白網(wǎng)絡(luò)相比，miRNAs表達(dá)特征譜作為一種新的強(qiáng)有力的工具，在組織器官的定向發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的時(shí)空調(diào)節(jié)、信號(hào)通路的開啟和關(guān)閉及疾病治療靶點(diǎn)確定的研究中更具獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。探討miRNAs在MSCs 成軟骨分化中的作用機(jī)制，將為進(jìn)一步理解MSCs 成軟骨分化的調(diào)

3、控網(wǎng)絡(luò)提供新的視角。
　　 本課題擬從三個(gè)部分的實(shí)驗(yàn)研究對(duì)miRNAs 介導(dǎo)的調(diào)控MSCs 成軟骨分化的生物學(xué)功能及分子機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的探討。
　　 1.利用小鼠骨髓來源MSCs，建立穩(wěn)定的體外誘導(dǎo)成軟骨分化細(xì)胞模型。通過miRNA芯片技術(shù)獲得小鼠MSCs成軟骨分化不同階段的miRNA表達(dá)譜，并以定量PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。再結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件和定量PCR 實(shí)驗(yàn)分析miRNA的靶基因，篩選出參與調(diào)控MSCs 成軟

4、骨分化的候選靶基因。
　　 2.結(jié)合生物信息學(xué)實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，驗(yàn)證候選miRNA作用于預(yù)測(cè)靶基因結(jié)合位點(diǎn)的真實(shí)性。
　　 3.利用C3H10T1/2 誘導(dǎo)成軟骨分化細(xì)胞模型，檢測(cè)針對(duì)候選miRNA的gain-of-function和loss-of-function 干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，各種軟骨特異性標(biāo)志表型的表達(dá)變化，證實(shí)候選miRNA 調(diào)控MSCs 成軟骨分化的生物學(xué)效應(yīng)。同時(shí)，以定量PCR和Westernblo

5、t 實(shí)驗(yàn)探索候選miRNA 調(diào)節(jié)靶基因的作用機(jī)制。
　　 通過上述三部分實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果顯示：1.通過直接貼壁法能夠獲得增殖能力強(qiáng)，MSCs 標(biāo)志CD分子表型一致，并具備多向分化能力(成骨分化、成脂分化和成軟骨分化)的小鼠骨髓來源MSCs?；诖朔椒ǚ蛛x的MSCs，我們選取了MSCs 成軟骨分化不同階段的細(xì)胞進(jìn)行miRNA 芯片掃描，包括：微團(tuán)培養(yǎng)的P3 MSCs，MSCs 誘導(dǎo)成軟骨分化7d，MSCs 誘導(dǎo)成軟骨分化14d，單層

6、培養(yǎng)的原代軟骨細(xì)胞。結(jié)果在MSCs 成軟骨過程中，表達(dá)發(fā)生顯著性改變的miRNAs 有13個(gè)(8個(gè)上調(diào)，5個(gè)下調(diào))。其中，miR-143/145和miR-132/212作為miRNA功能簇，在此進(jìn)程中表達(dá)逐步下調(diào)。qPCR 驗(yàn)證其中4個(gè)miRNAs的表達(dá)，與芯片結(jié)果一致，反映了芯片結(jié)果的可靠性。定量PCR 結(jié)果顯示，4個(gè)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)差異表達(dá)的miRNAs的軟骨相關(guān)靶基因在此進(jìn)程中的表達(dá)模式與相應(yīng)的miRNA表達(dá)模式呈相反趨勢(shì)。提示這些

7、差異表達(dá)的miRNAs 可能參與調(diào)控MSCs 成軟骨分化。
　　 2.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，調(diào)控軟骨形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Sox9及其協(xié)同效應(yīng)分子RelA分別是miR-145和miR-143的靶基因。為了驗(yàn)證其預(yù)測(cè)作用靶位點(diǎn)的真實(shí)性，我們分別成功構(gòu)建了針對(duì)miR-145和miR-143的陽性對(duì)照熒光報(bào)告載體(pMIR-PT)，包含預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)熒光報(bào)告載體(pMIR-MRE)和包含亂序排列的預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)熒光報(bào)告載體(pMIR-MUT

8、)。雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)，miR-145能與Sox9的3’-UTR上預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)有效結(jié)合，發(fā)揮抑制效應(yīng)。結(jié)合miRNA芯片結(jié)果顯示miR-145在誘導(dǎo)MSCs成軟骨分化中的顯著下調(diào)趨勢(shì)，進(jìn)一步提示miR-145 有可能通過調(diào)節(jié)靶基因Sox9，參與調(diào)控MSCs 成軟骨分化進(jìn)程。另一方面，miR-143的作用方式則不同于我們預(yù)期，我們僅得到了miR-143作用于RelA 預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)的陰性結(jié)果，其在MSCs 成軟骨分化中的作用有待于獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)

9、再次探索。
　　 3.在C3H10T1/2 誘導(dǎo)成軟骨分化細(xì)胞模型中，miR-145 過表達(dá)能抑制Sox9下游靶基因，同時(shí)也是軟骨形成特征型表型基因(Col2a1、Agc1、COMP、Col9a2、Col11a1)的mRNA表達(dá)。相反，抑制miR-145表達(dá)則顯著促進(jìn)上述基因mRNA表達(dá)。同時(shí)，miR-145 過表達(dá)能抑制細(xì)胞分泌軟骨特征型細(xì)胞外基質(zhì)GAGs。相反，抑制miR-145表達(dá)則顯著提升GAGs 形成。另外，miR-1

10、45 僅在蛋白水平調(diào)節(jié)靶基因Sox9的表達(dá)。
　　 另一方面，無論過表達(dá)或抑制miR-145表達(dá)，均對(duì)Sox9下游非軟骨形成相關(guān)特異性靶基因(C/EBPδ、C/EBPβ)的mRNA表達(dá)沒有影響。進(jìn)一步關(guān)于細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-145的改變并未對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響。研究結(jié)果證實(shí)miR-145 調(diào)控MSCs成軟骨分化的作用效應(yīng)，其作用機(jī)制是以轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)Sox9表達(dá)，從而特異性參與調(diào)控MSCs 成軟骨分化。
　　

11、綜上所述，本課題成功分離、培養(yǎng)小鼠骨髓來源MSCs，建立穩(wěn)定的體外誘導(dǎo)MSCs成軟骨分化的細(xì)胞模型。通過miRNA 芯片技術(shù)首次獲得小鼠MSCs 成軟骨分化4個(gè)不同階段的miRNA表達(dá)譜，并經(jīng)定量PCR 驗(yàn)證了部分結(jié)果；篩選出與軟骨形成相關(guān)候選miRNAs。驗(yàn)證了miR-145作用于Sox9的3’-UTR靶位點(diǎn)的真實(shí)性。同時(shí)也證實(shí)了RelA 并非miR-143的靶基因。證實(shí)在TGF-β3 驅(qū)動(dòng)的MSCs 成軟骨分化中，miR-145表達(dá)