MIF在低氧微環(huán)境調(diào)控人CESC成軟骨及成骨分化過程中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　椎間盤退變是引發(fā)下腰痛最重要的原因。軟骨終板(Cartilage endplate，CEP)的退變是椎間盤退變的始動(dòng)因素之一。CEP退變的重要特征是軟骨化程度降低而骨化程度增加。CEP中存在能向成軟骨方向和成骨方向分化，可以起到修復(fù)CEP作用的軟骨終板干細(xì)胞(Cartilage endplate stem cell，CESC)。CEP是一種無血管分布的低氧組織，在退變的CEP中，其生理性低氧微環(huán)境會(huì)遭到破壞。低氧對(duì)干細(xì)

2、胞的分化具有顯著的調(diào)控作用，目前低氧對(duì)CESC分化的作用尚無研究。
　　巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor, MIF)被認(rèn)為是低氧誘導(dǎo)因子-1A(hypoxia-inducible factor-1 alpha，HIF1A)的下游分子。MIF對(duì)軟骨和骨代謝有調(diào)控作用，然而MIF對(duì)干細(xì)胞成軟骨及成骨分化的作用卻沒有相關(guān)研究。本研究將著重研究HIF1A/MIF通路對(duì)CES

3、C成軟骨及成骨分化的調(diào)控作用。
　　方法：
　　第一部分:CEP退變/低氧的情況檢測(cè)及CESC原代分離培養(yǎng)
　　收集椎間盤退變組和未退變組病人的CEP樣本，檢測(cè)兩組樣本中HIF1A/COL1/COL2表達(dá)量的差異;從CEP樣本中提取并篩選CESC，并對(duì)干細(xì)胞特征進(jìn)行檢測(cè)。
　　第二部分:研究HIF1A/MIF通路對(duì)CESC成軟骨及成骨分化的調(diào)控作用
　　在常氧和低氧條件下分別對(duì)CESC進(jìn)行成軟骨分化和成骨分

4、化誘導(dǎo)，通過使用HIF1A的誘導(dǎo)劑/抑制劑，上調(diào)/下調(diào)MIF表達(dá)量來研究HIF1A/MIF通路對(duì)CESC成軟骨及成骨分化的調(diào)控作用。
　　第三部分:MIF調(diào)控SOX9/RUNX2的作用方式研究
　　通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)來研究在低氧條件下，MIF對(duì)SOX9/RUNX2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　第四部分:高通量芯片檢測(cè)CESC在常氧/低氧下基因表達(dá)及可變剪接的變化
　　使用HTA2.0芯片對(duì)CE

5、SC在常氧/低氧下成軟骨/成骨分化過程中的基因表達(dá)及可變剪接的變化
　　結(jié)果：
　　第一部分:
　　1.在退變的CEP中HIF1A表達(dá)量降低，COL2表達(dá)量降低，COL1表達(dá)量增加
　　2.CESC具備間充質(zhì)干細(xì)胞特性
　　第二部分
　　1.CESC在低氧環(huán)境下成軟骨能力增強(qiáng)而成骨能力減弱
　　2.低氧通過HIF1A增強(qiáng)CESC成軟骨分化能力抑制成骨分化能力
　　3.低氧/HIF1A對(duì)CE

6、SC分化的影響可以被MIF表達(dá)量的人為干預(yù)所逆轉(zhuǎn)
　　第三部分
　　1.在CESC中，MIF在低氧條件下有入核現(xiàn)象
　　2.在低氧條件下，MIF可以與SOX9啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄活性;與RUNX2啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄活性
　　第四部分
　　將低氧/常氧兩組樣本間的差異表達(dá)基因（Differentially expressed gene，DEG）和可變剪接(Alternative splicing，A

7、S)變化進(jìn)行檢測(cè)后所得的數(shù)據(jù)經(jīng)過基因本體(Geneontology，GO)分析和京都基因與基因組百科(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號(hào)通路分析，一些GO功能和通路被富集
　　結(jié)論：
　　1.在退變的CEP中低氧微環(huán)境被破壞，CEP軟骨化程度減少，骨化程度增加
　　2.低氧通過HIF1A/MIF通路增強(qiáng)CESC成軟骨分化能力抑制成骨分化能力
　　3.低氧