miR-141調(diào)控OP小鼠BMSCs成骨分化機(jī)制及健骨顆粒干預(yù)作用研究.pdf

1、目的:
　　探討絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程miR-141及BMP信號(hào)通路Dlx5/Msx2/Runx2信號(hào)軸的作用機(jī)制，從微小RNA功能調(diào)節(jié)角度揭示補(bǔ)腎健脾中藥健骨顆粒對(duì)BMSCs成骨分化的調(diào)控機(jī)制，為中醫(yī)藥防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、miR-141調(diào)控OP小鼠BMSCs成骨分化機(jī)制研究
　　1.1 miR-141內(nèi)源性表達(dá)與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性研究:采用卵巢切

2、除法建立小鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMOP)模型，分為模型組、假手術(shù)組。建模成功后，全骨髓法分離培養(yǎng)各組小鼠股骨BMSCs，流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)BMSCs進(jìn)行表型鑒定。通過(guò)測(cè)定生長(zhǎng)曲線、克隆形成情況觀察兩組細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)。RT-PCR檢測(cè)兩組miR-141內(nèi)源性表達(dá)情況。
　　1.2 miR-141及成骨基因Dlx5/Msx2/Runx2在BMSCs成骨分化過(guò)程中的表達(dá)及變化趨勢(shì)研究:用成骨誘導(dǎo)液對(duì)模型組、假手術(shù)組BMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)

3、，RT-PCR檢測(cè)3、8、13d時(shí)的miR-141及成骨基因Dlx5、Msx2、Runx2表達(dá)，同時(shí)行細(xì)胞形態(tài)觀察、堿性磷酸酶(ALP)染色及定量，Western blot驗(yàn)證RT-PCR結(jié)果。誘導(dǎo)13d后行茜素紅染色，觀察鈣化結(jié)節(jié)形成情況。
　　1.3 miR-141調(diào)控BMSCs成骨分化過(guò)程Dlx5/Msx2/Runx2信號(hào)軸的作用機(jī)制研究:使用miR-141的促進(jìn)物miR-141 mimics及miR-141抑制物inhib

4、itor通過(guò)Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BMSCs，3d后加入成骨誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)立NC對(duì)照組。細(xì)胞培養(yǎng)至8d時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察、ALP染色及定量檢測(cè);至13d時(shí)檢測(cè)miR-141及Dlx5、Msx2、Runx2的表達(dá)，并行鈣化結(jié)節(jié)的檢測(cè)。
　　2、健骨顆粒干預(yù)OP小鼠BMSCs成骨分化機(jī)制研究
　　2.1 健骨顆粒含藥血清調(diào)控miR-141對(duì)OP小鼠BMSCs成骨分化機(jī)制研究:取模型組BMSCs分成兩組行成

5、骨誘導(dǎo)，3d后分別加入健骨顆粒含藥血清和生理鹽水血清干預(yù)（每72小時(shí)干預(yù)一次），培養(yǎng)至8d時(shí)，行細(xì)胞形態(tài)觀察、ALP染色及定量;培養(yǎng)至13d時(shí)檢測(cè)miR-141及Dlx5、Msx2、Runx2的表達(dá)，同時(shí)行鈣化結(jié)節(jié)檢測(cè)。
　　2.2 在體實(shí)驗(yàn)對(duì)健骨顆粒影響miR-141調(diào)控OP小鼠BMSCs成骨分化的研究:卵巢切除法建立PMOP小鼠模型，分為假手術(shù)組10只、卵巢切除小鼠2組各10只，手術(shù)1周后，分別用健骨顆粒和生理鹽水對(duì)兩組卵巢切

6、除小鼠灌胃，假手術(shù)組用生理鹽水灌胃。2月后確定造模成功，取兩組卵巢切除小鼠骨組織行microCT骨質(zhì)疏松指標(biāo)及三維圖像、生物力學(xué)檢測(cè);并檢測(cè)骨組織miR-141及Dlx5、Msx2、Runx2表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、造模2月后去卵巢組較假手術(shù)組:骨小梁明顯減少，稀疏、斷裂;骨量下降，骨微結(jié)構(gòu)破碎;脛骨最大載荷明顯降低;BMSCs克隆數(shù)及細(xì)胞增殖能力6天、8天后明顯降低;miR-141內(nèi)源性表達(dá)明顯偏高。兩組BMSCs表型

7、CD29、CD44陽(yáng)性，CD34、CD45陰性。
　　2、成骨誘導(dǎo)后，兩組BMSCs組內(nèi)比較Dlx5、Runx2表達(dá)均持續(xù)上升，miR-141、Msx2持續(xù)下降;ALP逐漸提高，在中期（7天左右）達(dá)到高峰后逐漸降低，呈“∧”型變化。鈣化結(jié)節(jié)在誘導(dǎo)中期出現(xiàn)，后期達(dá)到極值。組間比較去卵巢組BMSCs較假手術(shù)組:細(xì)胞增殖降低，成骨分化減慢，差異在中期開(kāi)始明顯;miR-141、Msx2表達(dá)增高，Dlx5、Runx2表達(dá)降低;ALP及鈣化結(jié)

8、節(jié)降低。
　　3、網(wǎng)站預(yù)測(cè)并經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)驗(yàn)證了miR-141與Dlx5的3'-UTR序列存在結(jié)合位點(diǎn);細(xì)胞轉(zhuǎn)染后檢測(cè)成骨誘導(dǎo)8天時(shí)ALP與13天時(shí)鈣化結(jié)節(jié)的形成情況:與對(duì)照組相比，mimics組降低而inhibitor組升高，mimics組與inhibitor組差異明顯。轉(zhuǎn)染后第13天miR-141inhibitor組Dlx5、Runx2基因和蛋白表達(dá)均增加，Msx2表達(dá)減少，miR-141mimics組結(jié)果相反。

9、r>　　4、含藥血清濃度為10％時(shí)，健骨顆粒血清組與生理鹽水血清組成骨細(xì)胞數(shù)量較其它濃度時(shí)大，且組間差異最大。中藥血清組細(xì)胞增殖速度快，成骨分化程度高。中藥血清組細(xì)胞較空白血清組miR-141表達(dá)低，而Dlx5與Runx2表達(dá)高，Msx2表達(dá)低。
　　5、健骨顆粒灌胃組較生理鹽水灌胃組小鼠相比:骨量增加，骨小梁數(shù)量、寬度、長(zhǎng)度、形態(tài)和分布部分恢復(fù)，密度和聯(lián)結(jié)性增加，但還不能恢復(fù)到假手術(shù)組水平，皮質(zhì)骨面積增加，骨髓腔縮小，基本恢復(fù)到

10、假手術(shù)組水平;小鼠脛骨三點(diǎn)抗壓最大載荷明顯提高，但略低于假手術(shù)組:骨組織miR-141表達(dá)降低，而Dlx5與Runx2表達(dá)升高，Msx2表達(dá)降低。
　　結(jié)論:
　　1、卵巢切除法2月即可較好模擬人類(lèi)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的骨代謝狀態(tài)，造模成功。去卵巢可使BMSCs細(xì)胞增殖中后期明顯降低，細(xì)胞形態(tài)變差，且使miR-141內(nèi)源性表達(dá)增高，表明miR-141的內(nèi)源性表達(dá)與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥相關(guān)聯(lián)。
　　2、在成骨誘導(dǎo)過(guò)程中，miR-

11、141、Msx2是成骨負(fù)性調(diào)節(jié)因子，Dlx5、Runx2是正性調(diào)節(jié)因子;ALP作為成骨代謝合成酶，在隨細(xì)胞增殖、分化和衰老過(guò)程而出現(xiàn)峰值變化。鈣化結(jié)節(jié)作為成骨標(biāo)志在分化后期含量最高。
　　3、Dlx5是miR-141的靶基因，其關(guān)系為轉(zhuǎn)錄后抑制;miR-141通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制作用降低靶基因Dlx5的表達(dá)后，使Dlx5下游Runx2表達(dá)降低，而Msx2作為Dlx5的同源異形基因，在對(duì)Runx2的表達(dá)上具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。因此抑制miR-

12、141可級(jí)聯(lián)提高Dlx5/Msx2/Runx2信號(hào)軸成骨表達(dá)，從而促進(jìn)成骨。
　　4、10％的健骨顆粒含藥血清是促進(jìn)BMSCs增殖和成骨分化的最佳濃度;健骨顆粒含藥血清可抑制去卵巢小鼠BMSCs細(xì)胞中成骨負(fù)調(diào)節(jié)因子miR-141的高表達(dá)，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。
　　5、健骨顆?？梢种迫ヂ殉残∈蠊墙M織成骨負(fù)調(diào)節(jié)因子miR-141的高表達(dá)，并級(jí)聯(lián)提高Dlx5/Msx2/Runx2信號(hào)軸成骨表達(dá)來(lái)促進(jìn)骨組織成骨作用。健骨顆粒主要從