Ghrelin通過MAPK通路誘導兔BMSCs增殖及成骨分化的機制研究.pdf

1、骨髓基質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是干細胞家族的主要成員，其最初在骨髓被發(fā)現(xiàn)，它具有多項功能諸如，分化潛能，造血支持，免疫調(diào)節(jié)等。其增殖和分化為現(xiàn)如今的熱點。在1999年，Ghrelin被日本學者Kojima等發(fā)現(xiàn)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，它是由28個氨基酸殘基組成，分子量為3.3KD。Ghrelin是生長激素促分泌素受體(Growth hormone secretagogue rec

2、eptor, GHS-R)的內(nèi)源性配體，當它與其受體GHS-R結(jié)合后會產(chǎn)生具有很強的促進生長激素(Growth hormone, GH)釋放的作用。對MAPK途徑的研究主要表現(xiàn)在哺乳動物細胞中的研究，其主要方法是過表達、失活、基因沉默等方法。MAPK信號通路主要有4種類型，用它們的核心命名為MAPK。多種生理活動的調(diào)節(jié)均由其參與。每條通路都可以和其它通路相整合交叉，細胞的命運主要由他們的信號強弱及活化程度決定。
　　目的：本研究就

3、ghrelin對兔BMSCs（rBMSCs)的增殖與分化的作用，及ghrelin通過哪種途徑來實現(xiàn)對兔BMSCs的增殖與分化的作用機制進行研究。
　　方法：從健康清潔新西蘭大白兔體內(nèi)分離純化得到rBMSCs。傳代后免疫熒光檢測rMSCs細胞標記物CD44、CD34的表達，用MTT檢測不同代的rMSCs在10天內(nèi)的生長情況，從而得到最佳的生長時間。利用MTT法檢測不同濃度的Ghrelin對rMSCs的增殖作用，從而找到ghrelin

4、對rMSCs的增殖作用的最佳的作用濃度與作用時間。用western blot的方法來檢測Ghrelin對rMSCs不同時間點的MAPK通路的關(guān)鍵蛋白（ERK1/2,p38和JNK)的磷酸化情況，來研究Ghrelin發(fā)揮其作用的主要通路。為了進一步研究Ghrelin對rMSCs增殖的作用，將MAPK通路的關(guān)鍵蛋白進行抑制，用western blot來檢測其下游蛋白的磷酸化情況，及細胞增殖情況。同時用ghrelin受體抑制劑作用于細胞，用w

5、estern blot方法檢MAPK通路的關(guān)鍵蛋白（ERK1/2,p38和JNK)的磷酸化情況，用MTT法檢測細胞增殖情況。同時用ghrelin對rBMCs向成骨細胞分化的影響進行研究。用western blot檢測加入ghrelin后成骨細胞標志因子ALP,Runx2和Osterix的表達情況，同時檢測MAPK通路的關(guān)鍵蛋白（ ERK1/2,p38和JNK)的磷酸化情況，來確定ghrelin對rBMCs向成骨細胞分化影響的作用機制。用

6、MAPK通路的關(guān)鍵蛋白的抑制劑作用于細胞，及ghrelin受體抑制劑作用于rBMCs向成骨細胞分化的過程，在分別檢測ALP,Runx2和Osterix的表達情況。
　　結(jié)果：由新西蘭大白兔提rMSCs，經(jīng)培養(yǎng)得到較純的細胞，其在第四代的生長最佳，且CD44有強烈表達，而CD34則沒有表達。Ghrelin對rMSCs有明顯的促進生長的作用。Ghrelin對rMSCs的最佳作用濃度為600ng/ml，作用時間為第三天。用600ng/m

7、l的ghrelin作用于rBMCs并于0,20,40和60min后，磷酸化的ERK1/2的表達量在ghrelin作用后隨著作用時間的增加而增加（P<0.05）。且在40min時達到量高而后保持不變（P<0.05）。說明ghrelin對rBMCs的作用是通過ERK1/2通路起作用的。為了進一步證明ERK1/2通路的做用，用ERK1/2磷酸化抑制劑U0126作用細胞，發(fā)現(xiàn)ghrelin對細胞的促進生長作用消失。當細胞在600ng/ml Gh

8、relin的作用下，加入ghrelin受體抑制劑，抑制了細胞的生長。從而說明在Ghrelin促進rMSCs生長增殖時也是Ghrelin首先與其受體結(jié)合然后才發(fā)揮的促進作用的。在本研究中將ALP,Runx2和Osterix作為rBMSCs向成骨細胞分化的檢測指標，結(jié)果表明在ghrelin存在的情況下，ALP,Runx2和Osterix的表達量升高，更有利于rBMSCs向成骨細胞分化。為了進一步研究ghrelin促進rBMSCs向成骨細胞分

9、化的作用機制，本研究對MAPK通路的主要蛋白ERK1/2,JNK和p38磷酸化情況進行了檢測。結(jié)果表明ghrelin促進rBMSCs向成骨細胞分化主要是通過ERK1/2通路來實現(xiàn)的，為了進一步證明此機制，我們用ERK1/2磷酸化抑制劑U0126作用于rBMSCs，結(jié)果表明ERK1/2磷酸化被抑制，而ALP,Runx2和Osterix這三種蛋白的表達量均顯著下降，且低于只加地塞米松組的表達量，說明rBMSCs向成骨細胞分化過程減慢。進一步

10、證明了ghrelin促進rBMSCs向成骨細胞分化主要是通過ERK1/2通路來實現(xiàn)的。為了證明ghrelin促進rBMSCs向成骨細胞分化的實現(xiàn)是ghrelin先與其受體結(jié)合然后才發(fā)揮其作用的，本研究還用ghrelin受體抑制劑作用于rBMSCs后磷酸化的ERK1/2,JNK,P38的表達量在不同的時間段均沒有發(fā)生明顯的變化。同時檢測了細胞中ALP,Runx2和Osterix的表達量也沒有變化。表明ghrelin的促進作用受到抑制。