間斷性牽張力經(jīng)由p38MAPK-osterix信號通路促進小鼠BMSCs成骨向分化.pdf

1、目的:機械牽張應力刺激BMSCs成骨分化是牽張成骨、正畸牙移動以及骨折愈合過程中新骨生成的關(guān)鍵細胞學基礎。BMSCs是一類具有多向分化潛能的干細胞，也是對機械應力最敏感細胞之一。既往研究已證實牽張力可以誘導BMSCs成骨向分化。p38MAPK信號通路在炎癥反應，細胞周期調(diào)節(jié)和細胞分化等方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用，既往研究也發(fā)現(xiàn)p38MAPK與間充質(zhì)干細胞成骨分化關(guān)系密切。osterix是一種含鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在成骨細胞特異表達，是成骨分化和骨

2、生成的關(guān)鍵因素。研究表明機械力刺激可誘導osterix高表達。然而，目前有關(guān)p38MAPK信號通路和osterix與機械牽張力促進小鼠BMSCs成骨分化的關(guān)系以及二者間相互關(guān)系的研究，國內(nèi)外尚未見有報道。本研究擬以小鼠BMSCs為研究對象，配合多通道細胞牽張應力加載系統(tǒng)，構(gòu)建小鼠BMSCs體外培養(yǎng)-力學刺激模型、 Osterix基因沉默BMSCs模型。研究p38MAPK信號通路和Osterix與機械牽張力促進小鼠BMSCs成骨分化的關(guān)系

3、以及二者間的相互關(guān)系。我們的研究為細胞生物力學刺激成骨方面的機制提供了參考，可以根據(jù)其發(fā)展趨勢做進一步研究，為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　方法:BMSCs原代培養(yǎng):無菌下剝離C57BL/6J近交系小鼠雙側(cè)股骨和脛骨，應用全骨髓法進行原代BMSCs體外培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學表現(xiàn)、多向誘導分化及流式細胞表面分子鑒定。以體外原代培養(yǎng)的BMSCs為研究對象，通過成功構(gòu)建BMSCs體外培養(yǎng)-力學刺激模型，使用多通道細胞牽張應力加載

4、系統(tǒng)對BMSCs加載力學刺激。將C57BL/6J小鼠BMSCs分為空白對照組、牽張力組和牽張力阻斷組（SB203580（一種p38MAPK通路抑制劑）+牽張力），采用多通道細胞牽張應力加載系統(tǒng)，施加頻率為0.5Hz，振幅為0.8％的牽張力，每天2次，每次30min，分別在實驗第1、3、5天收獲BMSCs細胞。間斷性牽張力作用后，Real time-PCR檢測成骨基因ALP、COLI、OCN及Osterix的mRNA表達變化情況，West

5、ern blotting檢測及Osterix蛋白和P-p38MAPK蛋白的表達情況。用SB203580抑制P38MAPK信號通路后， Western blotting檢測及Osterix蛋白和P-p38MAPK蛋白的表達情況，Realtime-PCR檢測成骨基因ALP、COLI、OCN及Osterix的mRNA表達變化情況。通過siRNA技術(shù)沉默小鼠BMSCs的Osterix基因，Western blotting檢測Osterix蛋白的

6、表達情況，Real time-PCR檢測成骨相關(guān)基因ALP、COLI、OCN mRNA的表達量變化情況。應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。
　　結(jié)果:
　　1.C57BL/6J小鼠BMSCs傳代后細胞生長狀態(tài)穩(wěn)定，呈梭形;流式細胞鑒定結(jié)果顯示第2代BMSCs細胞均一性在90％以上，CD11b、CD34、CD45陰性細胞比例分別為5.87％、0.43％、4.43％; CD44、CD105、Sca-1陽性細胞

7、比例分別為99.67％、99.80％、99.81％。成骨誘導后，茜素紅染色可觀察到礦化結(jié)節(jié)，成脂誘導后油紅0染色細胞內(nèi)可見紅色脂滴。
　　2.牽張力作用后，可觀察到成骨相關(guān)基因ALP、COLI、OCN及Osterix mRNA表達水平增高，同一時間點，牽張力組上述基因與對照組相應基因相比差異具有統(tǒng)計學意義（*P＜0.05或**P＜0.01）。Western blotting結(jié)果顯示，牽張力組Osterix蛋白和P-p38MAPK的

8、蛋白水平明顯升高，同一時間點，牽張力組Osterix蛋白和P-p38MAPK的蛋白水平與對照組相應蛋白表達水平相比差異具有統(tǒng)計學意義（*P＜0.05或**P＜0.01）。
　　3.SB203580抑制P38MAPK信號通路后，小鼠BMSCs成骨相關(guān)基因ALP、COLI、OCN和Osterix mRNA的表達量降低，Western blotting結(jié)果也顯示相似的結(jié)果，同一時間點，阻斷組上述基因、蛋白表達水平與牽張力組相應基因和蛋白

9、表達水平相比差異具有統(tǒng)計學意義（*P＜0.05或**P＜0.01）。
　　4.沉默Osterix后，小鼠BMSCs成骨相關(guān)基因ALP、COLI、OCN mRNA的表達水平也隨之降低，同一時間點，牽張力對照組上述基因與牽張力-siRNA組相應基因相比差異具有統(tǒng)計學意義（*P＜0.05或**P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.間斷性牽張力可促進小鼠BMSCs成骨分化。
　　2.p38MAPK-Osterix通路在這