miR-22對人脂肪組織來源間充質干細胞成脂成骨分化的調控作用及其分子機制研究.pdf

1、間充質干細胞(mesenchymalstemcells,MSCs)作為一類具有多向分化潛能的細胞群體，在一定誘導條件下可以進行成脂分化或成骨分化。由于起源于同一細胞，MSCs的成脂分化和成骨分化又是一個相互抑制的過程。大量研究己分別對MSCs的成脂分化或成骨分化機制進行了詳細地探討，然而關于MSCs成脂成骨分化的雙向調控研究仍然太少。一些疾病的發(fā)生如“骨質疏松癥”和機體內脂肪細胞形成和成骨細胞形成平衡失調有關。因此，對MSCs成脂分化和

2、成骨分化之間平衡的調控進行機制探討對了解間充質干細胞的分化機制和骨相關疾病具有重要的意義。
　　 microRNAs(miRNAs)是一類長約20-25bp的非蛋白編碼小RNA，主要通過抑制其靶基因的蛋白表達在許多生物學過程中發(fā)揮著重要的調控作用。本文將以miR-22為主要研究對象，探討其對人脂肪源間充質干細胞(humanadiposetissuederivedmesenchymalstemcells，hADMSCs)成脂成骨分

3、化的影響，并對其調控機制進行了初步地探討。
　　 本研究第一部分主要探討miR-22對hADMSCs成脂成骨分化的影響。首先，我們對hADMSCs成脂成骨分化過程中miR-22的表達量變化分別進行了檢測，發(fā)現miR-22在成脂過程中表達量降低，而在成骨分化過程中表達升高，提示miR-22可能參與hADMSCs向成脂和成骨分化的調控。隨后，我們在hADMSCs中過表達miR-22，并對過表達miR-22的hADMSCs分別進行成脂

4、誘導培養(yǎng)和成骨誘導培養(yǎng)。我們發(fā)現miR-22含量升高顯著地抑制了hADMSCs內脂滴的形成，并使成脂分化關鍵轉錄因子PPARΥ和C/EBPα以及成脂特異標記物LPL和FABP4的表達量顯著下調。同時，我們發(fā)現miR-22過表達提高了細胞內堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性、促進了胞外基質鈣化并且使成骨特異標記物表達量顯著上調。上述結果表明miR-22抑制hADMSCs成脂分化，促進其成骨分化。
　　

5、 在本研究第二部分，我們對miR-22的下游靶基因進行了預測、篩選和鑒定。首先，通過miRNAs靶基因預測軟件TargetScan和miRanda對miR-22的靶基因進行預測初步挑選出7個與成脂分化或成骨分化調控直接或間接相關的靶基因作為候選靶基因；接下來我們通過熒光素酶實驗對候選靶基因進行再次篩選和鑒定，發(fā)現出miR-22可以結合HDAC6的3'UTR的互補配對區(qū)并發(fā)揮其轉錄后抑制作用。WesternBlot和RealTimePCR

6、結果表明miR-22可以在不影響HDAC6mRNA表達量的情況下，降低其蛋白含量。因此HDAC6被確定為miR-22的一個下游靶基因。我們將HDAC6作為下一部分的主要研究對象，探討miR-22調節(jié)hADMSCs成脂分化和成骨分化的分子機制。
　　 本研究第三部分主要對miR-22對hADMSCs成脂和成骨分化調節(jié)的下游機制，即miR-22靶基因“HDAC6”對hADMSCs成脂成骨分化的影響，進行了探討。首先通過Western

7、Blot和RealTimePCR檢測，發(fā)現HDAC6在hADMSCs成脂分化過程中上調，而在成骨分化過程中下調。通過RNA干擾(RNAinterference，RNAi)手段降低hADMSCs內HDAC6的表達，發(fā)現HDAC6表達下調后，顯著抑制了hADMSCs向成脂分化，但促進了其向成骨分化，與miR-22過表達后對hADMSCs分化的影響相一致。上述結果表明HDAC6可能是hADMSCs成脂分化的“促進因子”及成骨分化的“抑制因子”