牛間充質(zhì)干細(xì)胞成肌-成脂分化中差異miRNAs的鑒定及miR--23a調(diào)控機制研究.pdf

1、肌內(nèi)脂肪是衡量牛肉質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，與牛肉的多汁性、嫩度以及風(fēng)味有很大關(guān)系。骨骼肌和肌內(nèi)脂肪組織是由中胚層的間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來的。牛的骨骼肌的發(fā)生起始于妊娠早期，脂肪發(fā)生起始于妊娠中期。在胚胎及胎兒期，在轉(zhuǎn)錄因子和miRNAs等調(diào)控分子的調(diào)控下，間充質(zhì)干細(xì)胞向骨骼肌、骨骼、脂肪、成纖維、血管等細(xì)胞分化。充質(zhì)干細(xì)胞向骨骼肌和脂肪兩個方向的分化，對牛后天生產(chǎn)性能具有重要影響。為了探索miRNAs調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向骨骼肌和脂肪分化過程中的

2、機理，本研究以牛5月齡胎兒骨骼肌來源間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對象，建立了體外成肌分化和成脂分化模型，通過miRNA測序和生物信息學(xué)分析，篩選了骨骼肌和脂肪分化前后差異表達(dá)miRNAs，分析驗證了差異表達(dá)miRNAs中miR-23a在成脂分化過程中的功能和機理。得到如下主要結(jié)果:
　　1.在采用Ⅳ型膠原酶消化方法過程中，采用CD140a為表面標(biāo)記進(jìn)行成肌細(xì)胞和前體脂肪細(xì)胞的分離純化，對牛胎兒骨骼肌來源成肌細(xì)胞和前體脂肪細(xì)胞分離方法進(jìn)行優(yōu)化

3、。在成肌細(xì)胞分離純化方面，CD140a陰性細(xì)胞誘導(dǎo)后形成了大量的肌管，而CD140a陽性組肌管則很少、很短;免疫熒光鑒定顯示CD140a陰性細(xì)胞MyHC陽性表達(dá)，肌管的數(shù)量多、形態(tài)清晰，而CD140a陽性細(xì)胞肌管數(shù)量相對很少、形態(tài)不完整;定量PCR反應(yīng)結(jié)果表明，CD140a陰性細(xì)胞中MYOD、MYOG和MYF5三個基因表達(dá)水平要顯著高于CD140a陽性細(xì)胞。在前體脂肪細(xì)胞分離純化方面，CD140a陽性細(xì)胞出現(xiàn)了大量的脂肪滴，陽性細(xì)胞分化

4、成脂肪細(xì)胞的比例顯著高于陰性細(xì)胞;定量PCR反應(yīng)結(jié)果表明，CD140a陽性細(xì)胞中ZNF423、PPARγ、C/EBPα和FABP4四個基因表達(dá)水平要顯著高于CD140a陰性細(xì)胞。本研究建立了一種分離牛胎兒骨骼肌來源前體脂肪細(xì)胞和成肌細(xì)胞的優(yōu)化方法，為開展牛體外骨骼肌和脂肪誘導(dǎo)分化研究提供了一種有效的技術(shù)手段。
　　2.在前期采用地塞米松、IBMX、胰島素和羅格列酮聯(lián)合進(jìn)行誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上，本研究增加了BMP4對牛前體脂肪細(xì)胞進(jìn)行成脂誘

5、導(dǎo)，誘導(dǎo)后細(xì)胞質(zhì)中脂滴數(shù)量明顯增多，脂滴也更大，定量PCR反應(yīng)結(jié)果表明，BMP4實驗組中ZNF423、PPARγ、C/EBPα和FABP4四個基因表達(dá)水平均高于對照組。實驗結(jié)果表明，BMP4能夠促進(jìn)牛前體脂肪細(xì)胞體外成脂誘導(dǎo)。
　　3.通過miRNA測序和生物信息學(xué)分析，篩選出了骨骼肌和脂肪分化過程中差異表達(dá)miRNA，其中:以牛胎兒骨骼肌來源成肌細(xì)胞的成肌分化為研究對象，篩選出了成肌分化過程中的90個差異表達(dá)miRNAs，其中上

6、調(diào)的45個，下調(diào)的45個;以牛胎兒骨骼肌來源前體脂肪細(xì)胞分化為對象，篩選出了成脂分化過程中的56個差異表達(dá)miRNAs，其中上調(diào)的30個，下調(diào)的26個。
　　4.在牛胎兒骨骼肌來源前體脂肪細(xì)胞成脂分化中，本研究篩選出的miR-23a在誘導(dǎo)1d后表達(dá)量顯著降低并保持整個分化過程;轉(zhuǎn)染miR-23a模擬物會抑制脂肪分化，細(xì)胞中脂滴減少，PPARγ和C/EBPα的mRNA表達(dá)水平顯著降低;轉(zhuǎn)染miR-23a抑制物會促進(jìn)脂肪分化，細(xì)胞中脂