益腎骨康方對裸鼠溶骨性骨轉(zhuǎn)移瘤的干預(yù)作用機制研究.pdf

1、晚期惡性腫瘤比較容易轉(zhuǎn)移于骨組織，疼痛是其主要癥狀，如果不及時治療會發(fā)展至骨骼功能障礙、病理性骨折、骨髓功能抑制、高鈣血癥及癱瘓等因脊髓神經(jīng)受壓引起的嚴(yán)重并發(fā)癥。治療肺癌骨轉(zhuǎn)移瘤主要是為減癥治療，其目的主要是維持患者一般生活工作，防止骨折，控制疼痛，改善生活質(zhì)量，延長預(yù)期生存期。西藥治療有一定的毒副作用及成癮性，因此中醫(yī)中藥以副作用小、療效顯著的特點在骨轉(zhuǎn)移癌的治療方面發(fā)揮重要的作用。
　　本研究分4部分:
　　一、左心室注

2、射法裸鼠肺腺癌溶骨性骨轉(zhuǎn)移癌模型的建立；
　　二、益腎骨康方對溶骨性骨轉(zhuǎn)移瘤血清堿性磷酸酶的影響作用；
　　三、蛋白質(zhì)印跡法檢測扶正解毒化瘀中藥益腎骨康方對溶骨性骨轉(zhuǎn)移裸鼠基質(zhì)來源趨化因子蛋白表達的調(diào)控作用；
　　四、蛋白質(zhì)印跡法檢測扶正解毒化瘀中藥益腎骨康方對溶骨性骨轉(zhuǎn)移裸鼠趨化因子受體蛋白表達的調(diào)控作用。
　　一、左心室注射法裸鼠肺腺癌溶骨性骨轉(zhuǎn)移癌模型的建立
　　目的：本實驗利用左心室注射法注射獲得專

3、利的人肺腺癌溶骨性骨轉(zhuǎn)移細胞系CPA-YANG1BM，以建立溶骨性骨轉(zhuǎn)移模型，并以此模型為基礎(chǔ)，觀測中藥對其的干預(yù)作用。
　　方法：本實驗研究使用了獲得專利的人肺腺癌溶骨性骨轉(zhuǎn)移細胞系CPA-YANG1BM，由上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院楊順芳教授進行指導(dǎo)，使用左心室注射法建立裸鼠肺腺癌溶骨性骨轉(zhuǎn)移模型。將裸鼠隨機分為6組，每組6只，并于造模后第3天起給予藥物干預(yù)。5周后經(jīng)過micro SPECT/CT顯像和病理切片統(tǒng)計各組裸鼠骨轉(zhuǎn)移

4、數(shù)，計算各組骨轉(zhuǎn)移率及病理組織切片上腫瘤細胞數(shù)量與細胞總數(shù)的百分比。
　　結(jié)果：
　　1.帕米磷酸二鈉組發(fā)現(xiàn)1個骨轉(zhuǎn)移部位，其骨轉(zhuǎn)移率為17％;益腎骨康方高劑量組發(fā)現(xiàn)4個骨轉(zhuǎn)移部位，其骨轉(zhuǎn)移率為50％;益腎骨康方中劑量組發(fā)現(xiàn)2個骨轉(zhuǎn)移部位，其骨轉(zhuǎn)移率為33％;而模型對照組出現(xiàn)了12個骨轉(zhuǎn)移部位，其達到了百分之百的骨轉(zhuǎn)移率;益腎骨康方低劑量組與中西藥組沒有發(fā)現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移部位，其骨轉(zhuǎn)移率為零。
　　2.正常裸鼠骨皮質(zhì)及骨小梁發(fā)

5、育良好，正常的骨髓細胞充滿髓內(nèi)腔;模型對照組裸鼠可見腫瘤細胞幾乎完全填充整個骨髓腔，骨小梁破壞極其明顯，不見骨小梁結(jié)構(gòu)，顯微鏡下可見多個實性癌細胞團及多個多核巨細胞（破骨樣細胞）;可見皮質(zhì)受損嚴(yán)重，呈大片缺損狀，骨皮質(zhì)明顯變薄，而癌細胞在髓腔邊緣呈活躍狀態(tài)，骨小梁被損壞，癌細胞明顯向外發(fā)展。低劑量益腎骨康方組及西藥帕米膦酸二鈉組裸鼠骨髓腔內(nèi)少見多核巨細胞，髓腔內(nèi)腫瘤細胞不見，未見骨皮質(zhì)受損及骨小梁破壞;益腎骨康方高劑量組及中劑量組可見骨

6、皮質(zhì)、骨小梁受損程度比模型對照組明顯減輕，髓腔內(nèi)可見少量腫瘤細胞;可見中西藥組裸鼠骨皮質(zhì)受損，但仍較完整，髓腔內(nèi)可見腫瘤細胞，骨皮質(zhì)破壞及骨小梁受損在一定程度范圍內(nèi)。
　　結(jié)論：
　　1.成功培育人肺腺癌骨轉(zhuǎn)移細胞株CPA-YANG1BM;
　　2.根據(jù)micro-Spect/CT顯像結(jié)果顯示，模型對照組均出現(xiàn)多個部位的骨轉(zhuǎn)移，證實溶骨性骨轉(zhuǎn)移造模成功;
　　3.根據(jù)病理組織切片結(jié)果顯示，骨轉(zhuǎn)移灶均為肺腺癌，證實

7、溶骨性骨轉(zhuǎn)移造模成功;
　　4.扶正解毒化瘀中藥益腎骨康方可以減少裸鼠骨轉(zhuǎn)移率，抑制骨轉(zhuǎn)移部位增多;
　　5.扶正解毒化瘀中藥益腎骨康方可以減輕骨轉(zhuǎn)移灶的骨質(zhì)損壞，降低裸鼠骨轉(zhuǎn)移灶內(nèi)腫瘤細胞與總細胞的比值。
　　二、益腎骨康方對溶骨性骨轉(zhuǎn)移瘤血清堿性磷酸酶的影響作用
　　目的：本實驗研究在前期工作的基礎(chǔ)上深入探究益腎骨康方對血清堿性磷酸酶的影響作用。
　　方法：以肺腺癌溶骨性骨轉(zhuǎn)移裸鼠模型為動物基礎(chǔ)模型，使

8、用酶免疫熒光法測定血清tALP，分別觀測各組裸鼠血清堿性磷酸酶的數(shù)值。
　　結(jié)果：模型對照組裸鼠血清堿性磷酸酶平均水平高于正常值一倍，益腎骨康方中劑量組與模型對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，益腎骨康方高劑量組及西藥組血清堿性磷酸酶較模型對照組下降，與模型對照組相比有顯著性差異(P＜0.05);益腎骨康方低劑量組、中西藥組所測血清堿性磷酸酶與模型對照組相比有極顯著性差異(P＜0.01);西藥組、益腎骨康方高劑量組及益腎骨康方

9、中劑量組血清堿性磷酸酶無顯著性差異(P＞0.05)。上述結(jié)果表明益腎骨康方及帕米磷酸二鈉能夠降低溶骨性骨轉(zhuǎn)移瘤裸鼠血清堿性磷酸酶。
　　結(jié)論：
　　1.扶正解毒化瘀中藥益腎骨康方可以降低血清堿性磷酸酶的異常升高，以降低骨質(zhì)破壞率，從而抑制骨轉(zhuǎn)移的形成;
　　2.血清堿性磷酸酶可作為骨轉(zhuǎn)移瘤的診斷、監(jiān)測預(yù)后、化療效果、手術(shù)效果評價的血清學(xué)檢驗指標(biāo)。
　　三、蛋白質(zhì)印跡法檢測扶正解毒化瘀中藥益腎骨康方對溶骨性骨轉(zhuǎn)移裸

10、鼠基質(zhì)來源趨化因子蛋白表達的調(diào)控作用
　　目的：本實驗研究在前期工作的基礎(chǔ)上，深入探究益腎骨康方對溶骨性骨轉(zhuǎn)移裸鼠CXCL12蛋白表達的調(diào)控作用。
　　方法：以肺腺癌溶骨性骨轉(zhuǎn)移裸鼠模型為基礎(chǔ)，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測益腎骨康方對溶骨性骨轉(zhuǎn)移裸鼠CXCL12蛋白的表達。并使用Image J圖像分析軟件進行圖像分析。
　　結(jié)果：模型對照組、西藥組CXCL12蛋白的表達較高，相比無顯著性差異(P＞0.05);益腎骨康方高劑量組

11、、中劑量組CXCR12蛋白的表達較低，與模型對照組相比有顯著性差異(P＜0.05);益腎骨康方低劑量組與中西藥組未發(fā)生骨轉(zhuǎn)移瘤，CXCR12蛋白表達極低，與模型對照組相比有極顯著性差異(P＜0.01);西藥組與模型對照組骨轉(zhuǎn)移瘤CXCL12蛋白的表達無顯著性差異(P＞0.05);益腎骨康方高劑量組與中劑量組CXCR12蛋白的表達無顯著性差異(P＞0.05)。上述結(jié)果表明益腎骨康方能夠降低CXCL12蛋白的表達，而帕米磷酸二鈉對CXCL1

12、2蛋白表達幾乎沒有降低作用。
　　結(jié)論：扶正解毒化瘀中藥益腎骨康方可以通過抑制CXCR12的表達進而抑制骨組織對癌細胞的趨化作用，起到防止骨破壞的作用，從而抑制骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生。
　　四、蛋白質(zhì)印跡法檢測扶正解毒化瘀中藥益腎骨康方對溶骨性骨轉(zhuǎn)移裸鼠趨化因子受體蛋白表達的調(diào)控作用
　　目的：本實驗研究以前期工作為基礎(chǔ)，深入探討扶正解毒化瘀中藥益腎骨康方對溶骨性骨轉(zhuǎn)移裸鼠CXCR4蛋白表達的調(diào)控作用。
　　方法：以肺腺癌

13、溶骨性骨轉(zhuǎn)移裸鼠模型為基礎(chǔ)，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測益腎骨康方對溶骨性骨轉(zhuǎn)移裸鼠CXCR4蛋白的表達。并使用Image J圖像分析軟件進行圖像分析。
　　結(jié)果：模型對照組、西藥組、益腎骨康方高劑量組及中劑量組股骨轉(zhuǎn)移瘤CXCR4蛋白的表達較高，與模型對照組相比無顯著性差異(P＞0.05);益腎骨康方低劑量組骨轉(zhuǎn)移瘤CXCR4蛋白幾乎不表達，與模型對照組及其它組相比有顯著性差異(P＜0.05)，中西醫(yī)結(jié)合組CXCR4表達呈陰性結(jié)果，與模