益腎健骨合劑在自體骨修復(fù)骨缺損中的干預(yù)效應(yīng)及IGF-1表達(dá)的研究.pdf

1、目的：探討中藥復(fù)方“益腎健骨合劑”在自體骨修復(fù)骨缺損中的干預(yù)效應(yīng)及與IGF-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）生長(zhǎng)因子的表達(dá)關(guān)系。
　　方法：新西蘭大耳白兔90只，雌雄不限，體重（2.0±0.5）kg。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、有效對(duì)照組和對(duì)照組各30只。分別于術(shù)后1、2、4、6、8周每組隨機(jī)處死6只新西蘭大耳白兔,取其橈骨原骨缺損植骨處生長(zhǎng)組織檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)組、有效對(duì)照組與對(duì)照組均在氯胺酮30mg/kg

2、肌注麻醉后，按無(wú)菌操作技術(shù)行左側(cè)橈骨中上段截骨，造成15mm骨和骨膜缺損，兩端髓腔用骨臘封閉，另取雙側(cè)自體髂骨制成2×2×2mm的粒狀骨，于骨缺損處植入上述粒狀骨。創(chuàng)口嚴(yán)密縫合，不做內(nèi)、外固定，分籠喂養(yǎng)。術(shù)后實(shí)驗(yàn)組用含中藥復(fù)方“益腎健骨合劑”的混合飼料喂養(yǎng)?！耙婺I健骨合劑”由鹿茸、淫羊藿、杜仲、水蛭、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷、自然銅、土鱉蟲(chóng)組成，是根據(jù)《中國(guó)藥典》“跌打活血散”及東北長(zhǎng)白山地區(qū)民間促骨愈合秘方組合加減配制而成。有效對(duì)照組用含傷科接骨

3、片的飼料喂養(yǎng)。對(duì)照組用不含中藥的普通飼料喂養(yǎng)。自由活動(dòng)，術(shù)后肌肉注射慶大霉素3天，預(yù)防感染。術(shù)后分別在1、2、4、6、8周時(shí)行兔橈骨X-線(xiàn)檢查，并取兔橈骨骨缺損處組織作為標(biāo)本，進(jìn)行HE染色、電鏡、免疫組織化學(xué)、原位雜交、RT-PCR檢測(cè)，具體觀察和分析“益腎健骨合劑”在自體骨修復(fù)骨缺損中的干預(yù)效應(yīng)及胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）的表達(dá)關(guān)系。
　　結(jié)果：
　?。?）X線(xiàn)片檢查：1周時(shí)實(shí)驗(yàn)組、有效對(duì)照組和對(duì)照組修復(fù)區(qū)均無(wú)明顯

4、差異變化，可以看到骨缺損處移植的小顆粒狀骨影，界限清晰，無(wú)新生骨痂形成；2周時(shí)實(shí)驗(yàn)組及有效對(duì)照組開(kāi)始有少量骨痂形成，骨缺損界限仍清晰，對(duì)照組骨吸收明顯；4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組及有效對(duì)照組均有片狀骨痂形成，骨痂形成量較前明顯增多。相對(duì)于實(shí)驗(yàn)組比較，有效對(duì)照組片狀骨痂較少。而對(duì)照組有部分骨痂形成，缺損區(qū)骨質(zhì)稀疏；6周時(shí)實(shí)驗(yàn)組骨缺損處骨痂生長(zhǎng)連續(xù)，缺損區(qū)示模糊不清，可見(jiàn)大量增生的編織骨。有效對(duì)照組出現(xiàn)少量編織骨，但部分區(qū)域有骨吸收表現(xiàn)。而對(duì)照組骨缺損處

5、雖有輕微模糊改變，但部分骨質(zhì)出現(xiàn)硬化改變；8周時(shí)可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組及有效對(duì)照組骨缺損處形成大量骨痂，成彌漫性密度增高影，而且實(shí)驗(yàn)組骨缺損有部分骨髓腔形成。但對(duì)照組第8周時(shí)仍未有骨髓腔的再通跡象。對(duì)照組骨缺損修復(fù)區(qū)雖然同樣形成骨痂，但是相比實(shí)驗(yàn)組、有效對(duì)照組而言，骨痂形成量少且生長(zhǎng)不均勻。
　　（2）HE染色：實(shí)驗(yàn)組及有效對(duì)照組與對(duì)照組在第1周時(shí)移植骨內(nèi)有部分骨細(xì)胞壞死、細(xì)胞核濃縮、甚至消失，移植骨內(nèi)有成纖維細(xì)胞增生并伴有炎性細(xì)胞生成；2-

6、4周時(shí)移植骨內(nèi)有少量軟骨細(xì)胞形成。同時(shí)實(shí)驗(yàn)組伴有大量血管生長(zhǎng)，移植骨內(nèi)細(xì)胞明顯吸收并有核濃縮碎裂現(xiàn)象。有效對(duì)照組伴有較多血管生長(zhǎng)，移植骨內(nèi)有細(xì)胞吸收并也出現(xiàn)核濃縮碎裂現(xiàn)象；6-8周時(shí)移植骨區(qū)的血管數(shù)量增多，實(shí)驗(yàn)組有明顯網(wǎng)狀新骨生成，并伴有骨髓腔的形成，有效對(duì)照組可見(jiàn)網(wǎng)狀新骨生成，并伴有少量骨髓腔的形成。對(duì)照組1周時(shí)移植區(qū)也有大量的炎性反應(yīng)與實(shí)驗(yàn)組無(wú)明顯變化；但是在2-4周后且伴有少量軟骨細(xì)胞和血管形成；6-8周時(shí)骨痂量增多并伴有血管的增

7、多，但尚未形成骨髓腔。
　?。?）電鏡觀察：1周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組、有效對(duì)照組和對(duì)照組均有部分骨小梁壞死狀物，并伴有較多炎性細(xì)胞的產(chǎn)生；2周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)細(xì)胞呈梭形，骨細(xì)胞核濃縮，染色質(zhì)凝聚靠邊，有效對(duì)照組亦可見(jiàn)梭形細(xì)胞；對(duì)照組未見(jiàn)梭形細(xì)胞生成，骨細(xì)胞周?chē)梢?jiàn)膠原纖維，核基質(zhì)致密靠邊；4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組毛細(xì)血管數(shù)量增多，骨陷窩及骨小梁形成，有效對(duì)照組毛細(xì)血管數(shù)量也增多，但是骨細(xì)胞、骨陷窩及骨小梁形成相對(duì)較少。而對(duì)照組毛細(xì)血管數(shù)量相對(duì)較少并伴周

8、圍有骨基質(zhì)形成；6-8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)成骨細(xì)胞形成，胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯增多。有效對(duì)照組可見(jiàn)骨原細(xì)胞相對(duì)活躍。而對(duì)照組骨原細(xì)胞數(shù)量少，骨基質(zhì)大量形成，無(wú)明顯骨小梁形成。
　?。?）免疫組織化學(xué)：1周時(shí)對(duì)照組、有效對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組IGF-1染色見(jiàn)骨細(xì)胞胞漿呈彌漫性淡染，但各組無(wú)明顯區(qū)別，均呈弱陽(yáng)性表達(dá)；2周時(shí)實(shí)驗(yàn)組骨原細(xì)胞染色加深，IGF-1染色呈陽(yáng)性表達(dá)，有效對(duì)照組骨原細(xì)胞也可見(jiàn)部分加深，呈弱陽(yáng)性表達(dá)，而對(duì)照組仍呈現(xiàn)彌漫性的淡染

9、表達(dá)；4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組IGF-1染色呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，伴隨骨髓腔的形成，成骨細(xì)胞著色較深，軟骨細(xì)胞也可見(jiàn)濃染。有效對(duì)照組IGF-1染色呈陽(yáng)性表達(dá)，伴隨骨髓腔的形成，骨細(xì)胞著色。而對(duì)照組也染色加深但濃度略淡于有效對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，呈弱陽(yáng)性表達(dá)；6-8周時(shí)各組骨組織細(xì)胞的IGF-1染色較前均呈相應(yīng)程度的減弱表達(dá)，對(duì)照組呈弱陽(yáng)性表達(dá)，有效對(duì)照組呈陽(yáng)性表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組仍呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。
　?。?）原位雜交：1周時(shí)對(duì)照組、有效對(duì)照組均與實(shí)驗(yàn)組無(wú)明顯差異，I

10、GF-1探針染色均呈弱陽(yáng)性表達(dá)；2周時(shí)實(shí)驗(yàn)組IGF-1探針染色呈陽(yáng)性表達(dá)。有效對(duì)照組IGF-1探針染色基質(zhì)著色呈弱陽(yáng)性表達(dá)，可見(jiàn)部分骨組織細(xì)胞著色，而對(duì)照組IGF-1探針染色著色較有效對(duì)照組略少呈弱陽(yáng)性表達(dá)；4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組IGF-1探針染色基質(zhì)著色呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，有效對(duì)照組 IGF-1探針染色見(jiàn)骨細(xì)胞著色呈陽(yáng)性表達(dá)，而對(duì)照組IGF-1探針染色著色呈弱陽(yáng)性表達(dá)；6-8周時(shí)各組均可見(jiàn)骨小梁形成，骨組織細(xì)胞數(shù)也較前增多，但骨組織細(xì)胞探針染色著色表

11、達(dá)均較前開(kāi)始減弱。有效對(duì)照組 IGF-1探針染色呈弱陽(yáng)性表達(dá)，而對(duì)照組IGF-1探針染色著色較有效對(duì)照組表達(dá)減弱。實(shí)驗(yàn)組IGF-1探針染色呈陽(yáng)性表達(dá)。
　?。?）RT-PCR結(jié)果：IGF-1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量在第1-4周呈上升趨勢(shì)，第6-8周呈下降趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)組與有效對(duì)照組IGF-1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量均比對(duì)照組高，其中實(shí)驗(yàn)組IGF-1在第2-8周的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.01），第1周最低，表達(dá)量為1

12、.302±0.058；在第4周達(dá)到最高，表達(dá)量為3.914±0.273；有效對(duì)照組IGF-1在第2-8周的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.01），第1周最低，表達(dá)量為1.278±0.074；在第4周達(dá)到最高，表達(dá)量為3.286±0.181。有效對(duì)照組IGF-1在1-8周的相對(duì)表達(dá)量均要低于實(shí)驗(yàn)組，其中在第4周的表達(dá)量?jī)烧弑容^有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。
　　結(jié)論：中西醫(yī)結(jié)合治療骨缺損療效滿(mǎn)意。中藥復(fù)方“益腎健骨合劑”