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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
骨缺損的修復(fù)是臨床治療的巨大挑戰(zhàn),傳統(tǒng)的自體骨移植因來(lái)源有限和供區(qū)損傷等問(wèn)題具有很大的局限性。組織工程骨的發(fā)展為骨缺損治療開辟了嶄新的途徑。然而,體外培養(yǎng)組織工程骨過(guò)程復(fù)雜且成本高昂,已經(jīng)開展的臨床試驗(yàn)數(shù)量很少,因此,組織工程骨尚不能常規(guī)進(jìn)入臨床使用。由于骨髓血中富含骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),新鮮采集的骨髓血常被用于輔助骨缺損的修復(fù),通過(guò)將骨髓血中的骨髓單個(gè)
2、核細(xì)胞(bone marrow mononuclear cells,BMMNCs)濃縮富集,可提高干細(xì)胞的濃度。近年來(lái),已經(jīng)有許多直接運(yùn)用濃縮骨髓進(jìn)行骨缺損修復(fù)的臨床報(bào)道,并且開始逐漸推廣。這種方法與經(jīng)典的組織工程骨相比,二者修復(fù)效果有何差別尚無(wú)相關(guān)報(bào)道,特別是缺乏詳細(xì)的大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。為此,在大動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建節(jié)段性骨缺損模型,以β-磷酸三鈣(tricalcium phosphate,TCP)為支架,比較運(yùn)用BMMNCs和經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增的
3、BMSCs修復(fù)骨缺損的差異,并進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)一年的觀察。用多種先進(jìn)的技術(shù)手段對(duì)兩種方法形成的再生骨組織進(jìn)行了形態(tài)、化學(xué)構(gòu)成及生物力學(xué)的研究和比較,并找到了再生骨組織與自體正常骨組織之間的差異。此外,首次使用BMMNCs復(fù)合β-TCP修復(fù)臨床齒槽裂骨缺損,并通過(guò)三維CT與傳統(tǒng)的自體骨移植進(jìn)行了為期一年的隨訪比較,為BMMNCs進(jìn)一步的臨床應(yīng)用打下了重要的基礎(chǔ)。
方法:
1.制備BMMNCs/β-TCP和BMSCs/β-TC
4、P兩種移植物:從比格犬髂后上嵴抽取骨髓血15ml,以Ficoll密度梯度離心法制備BMMNCs,將其體積濃縮為500μl,然后接種至加工好的圓柱形β-TCP支架上。用瑞氏-姬姆薩染色觀察處理前后骨髓血成分的變化,同時(shí)以犬細(xì)胞因子芯片測(cè)量BMMNCs中常見細(xì)胞因子的含量,并與外周血、未濃縮骨髓血作比較。同樣方法抽取15ml骨髓血,從中分離培養(yǎng)BMSCs,擴(kuò)增至P1代時(shí),調(diào)整細(xì)胞濃度為20×106/ml,體積500μl,接種至相同支架上,換
5、用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)14天。以CM-Dil染料染色后在共聚焦顯微鏡下觀察兩種移植物細(xì)胞分布情況。
2.比格犬脛骨節(jié)段性骨缺損的修復(fù):建立比格犬脛骨節(jié)段性骨缺損模型,應(yīng)用制備好的BMMNCs/β-TCP移植物、BMSCs/β-TCP移植物進(jìn)行修復(fù),以單純?chǔ)?TCP支架和空白處理作為對(duì)照。術(shù)后2周,3月,6月,12月分別行X線觀察,術(shù)后12月行SPECT-CT檢查,12月取材后通過(guò)大體觀察,Micro-CT,硬組織切片組織學(xué)
6、檢查評(píng)價(jià)修復(fù)效果。
3.再生骨組織的微觀結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成與生物力學(xué)分析:以BMMNCs/β-TCP和BMSCs/β-TCP兩種典型的方法修復(fù)比格犬脛骨節(jié)段性骨缺損,術(shù)后12月取材,同時(shí)取對(duì)側(cè)自體骨為對(duì)照,樣本包埋并打磨后,以雙光子和二次諧波顯微顯像的方法檢測(cè)骨組織的膠原和血管等細(xì)微結(jié)構(gòu),以激光拉曼光譜檢測(cè)骨組織化學(xué)成分,以納米壓痕儀檢測(cè)骨組織微觀力學(xué)性能。
4.BMMNCs復(fù)合β-TCP修復(fù)臨床齒槽裂:首先定量分析齒槽
7、裂缺損的體積,采用三維打印和計(jì)算機(jī)輔助法計(jì)算骨缺損區(qū)域體積,以明確所需移植物量;然后分別以BMMNCs復(fù)合β-TCP和自體髂骨移植物進(jìn)行骨缺損修復(fù)。術(shù)后3月,6月,12月進(jìn)行三維CT影像學(xué)分析,評(píng)估缺損修復(fù)情況和移植物變化。
結(jié)果:
1.從比格犬15ml骨髓血中平均獲取BMMNCs濃度為33.0±8.8×106/ml,濃縮后可見其成分主要為有核細(xì)胞,而紅細(xì)胞含量大幅下降,細(xì)胞在β-TCP支架上均勻散在分布,鏡下呈圓形
8、。細(xì)胞因子分析顯示,IL-8在BMMNCs中明顯高于外周血和未濃縮的骨髓血,而BMMNCs和骨髓血中晚期糖基化終產(chǎn)物受體(the receptor of advanced glycation end products,RAGE)和干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF)的濃度則較外周血低。15ml骨髓血經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增后獲得BMSCs細(xì)胞濃度為20×106/ml,體外成骨誘導(dǎo)成功,細(xì)胞在支架上交織成網(wǎng)狀緊密黏附。
2.
9、比格犬脛骨節(jié)段性缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)中,BMMNCs組表現(xiàn)出更好的修復(fù)效果,該組80%的動(dòng)物均在術(shù)后3月即形成了明顯的骨連接,取出內(nèi)固定后無(wú)再骨折發(fā)生;術(shù)后12月可見骨痂改建,骨皮質(zhì)密度增加,髓腔形成,移植物與自體骨組織銜接良好,無(wú)明顯分界。在BMSCs組中,術(shù)后3月與6月截骨線仍明顯,無(wú)法及時(shí)拆除內(nèi)固定,移植物與自體脛骨分界清晰,大量支架未能降解,支架周圍骨質(zhì)菲薄,但支架內(nèi)部可見較多的骨組織形成。單純支架組的移植物術(shù)后6月幾乎完全吸收。SPE
10、CT-CT示BMMNCs組移植物區(qū)域較BMSCs組有更明顯的放射性濃聚,表明其代謝活躍。Micro-CT分析BMMNCs組平均骨組織體積為1231.38mm3,骨組織占比65.14%。BMSCs組平均骨組織體積為755.65mm3,骨組織占比41.29%,二者差異具有顯著性。
3.雙光子和二次諧波信號(hào)顯示BMMNCs組樣本的膠原纖維貼附于孔壁,呈層狀排列,或在孔中央呈同心圓樣排列形成類哈弗斯管結(jié)構(gòu),骨細(xì)胞位于膠原層之間,血管位
11、于膠原中央或貼附于材料孔壁上。在BMSCs組樣本中,可見膠原纖維呈束狀由孔壁或聯(lián)通孔處發(fā)散,密度較BMMNCs組低,同心圓結(jié)構(gòu)不明顯。拉曼光譜檢測(cè)顯示BMMNCs組樣本、BMSCs組樣本和自體脛骨組織的峰位相似,但強(qiáng)度不同。BMNNCs組的礦物/基質(zhì)比顯著高于BMSCs組;碳酸/磷酸比在自體骨組織中較再生骨組織低;膠原交聯(lián)比在BMMNCs組樣本中較自體骨低,但在BMSCs組則與自體骨無(wú)顯著差異;碳酸/氨基酸Ⅰ比值在BMMNCs組中顯著升
12、高,可見該組樣本中存在很活躍的骨改建活動(dòng)。納米壓痕結(jié)果顯示BMMNCs組樣本的壓痕模量為15.61Gpa,硬度為0.67Gpa,與自體骨組織相似,并顯著高于BMSCs組。
4.術(shù)前齒槽裂患者的骨缺損體積在3D打印模型上計(jì)算所得平均值為1.52ml,略高于通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助工程(computer aided engineering,CAE)軟件計(jì)算的體積(1.47ml),二者無(wú)顯著差異,兩種方法均適用于齒槽裂的術(shù)前評(píng)估。在齒槽裂修復(fù)
13、研究中,所有的患者術(shù)區(qū)均愈合良好,沒有嚴(yán)重并發(fā)癥出現(xiàn)。BMMNCs組多數(shù)患者(8/10)的齒槽裂得到了較好的修復(fù),形成了骨連接。術(shù)后3月,BMMNCs組移植物的平均體積為7245±220.5mm3。術(shù)后六月,移植物體積降低至6122±211.5mm3。術(shù)后12月平均BV與術(shù)后六月相似,為5890±180.5mm3。自體髂骨組與BMMNCs組相似,術(shù)后6月移植物平均體積為678.7±2110mm3與BMMNCs組相似,術(shù)后12月移植物平均
14、體積與6月時(shí)相似,為635.3±1975mm3。兩種方法相比無(wú)顯著差異。
結(jié)論:
1.在比格犬脛骨節(jié)段性缺損的修復(fù)中,采用直接濃縮制備的BMMNCs結(jié)合β-TCP材料比采用經(jīng)體外培養(yǎng)并成骨誘導(dǎo)后的BMSCs效果更好。
2.與BMSCs相比,BMMNCs結(jié)合β-TCP策略形成的骨組織更加豐富,其化學(xué)成分、生物力學(xué)性質(zhì)也與自體骨組織更加接近。
3.在齒槽裂修復(fù)中,缺損體積在術(shù)前通過(guò)3D打印模型和CAE
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