誘導(dǎo)膜活化滅活自體骨修復(fù)骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、研究背景:
　　近年來，四肢大段骨缺損的修復(fù)重建取得了巨大進(jìn)步，但仍然是困擾骨科醫(yī)生的主要難題之一，理想的治療目標(biāo)不僅要實(shí)現(xiàn)骨缺損的快速愈合，同時(shí)要減少對(duì)患者的不利影響，最后恢復(fù)患肢的功能。目前經(jīng)典的重建方法包括自體松質(zhì)骨移植，Ilizarov技術(shù)以及帶血管腓骨移植技術(shù)，這些方法在四肢骨缺損修復(fù)重建過程中取得了巨大的成功，至今仍發(fā)揮著不可或缺的作用，但這幾種骨重建技術(shù)存在一定的局限性仍需要改進(jìn)。自體松質(zhì)骨移植僅適用于修復(fù)4-6

2、cm以內(nèi)的骨缺損，否則移植骨可能被吸收導(dǎo)致骨重建失敗。骨搬移技術(shù)治療周期較長，患肢佩戴大體積的外固定架對(duì)患者的日常生活影響較大，治療過程極為痛苦，患者不易耐受。帶血管腓骨移植技術(shù)對(duì)修復(fù)大段骨缺損具有一定優(yōu)勢，但是對(duì)設(shè)備和技術(shù)要求較高，還容易出現(xiàn)骨連接不正、骨延遲愈合或不愈合、供骨區(qū)和受骨區(qū)同時(shí)失敗的風(fēng)險(xiǎn)和并發(fā)癥[1-3]。2000年Masquelet等[4]報(bào)道了膜誘導(dǎo)技術(shù)治療四肢節(jié)段性骨缺損，因?yàn)榫哂谐晒β矢?、并發(fā)癥少、操作簡單等優(yōu)勢

3、逐步被越來越多的骨科醫(yī)師所認(rèn)可。該技術(shù)治療骨缺損主要通過兩期手術(shù)完成，首先對(duì)骨缺損及周圍清創(chuàng)，去除感染、壞死的組織，局部填塞聚甲基丙烯酸甲酯(PolymethylMethacrylatePMMA)骨水泥誘導(dǎo)周圍形成一層具有生物活性的膜，稱為誘導(dǎo)膜，二期(6-8周后)在膜內(nèi)植入顆粒狀自體松質(zhì)骨修復(fù)骨缺損。早期研究顯示該技術(shù)修復(fù)骨缺損成功率高達(dá)88％～100％，能夠成功修復(fù)長達(dá)25cm的骨缺損[5-7]。目前認(rèn)為膜誘導(dǎo)技術(shù)治療四肢骨缺損成功

4、率高的關(guān)鍵因素是骨水泥誘導(dǎo)形成的生物膜，它不僅能維持移植骨的形態(tài)，防止移植骨被周圍組織吸收，同時(shí)能為移植骨成骨提供必須的血供及多種成骨生長因子，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2）、血管內(nèi)皮生長因子（Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）等[5]。誘導(dǎo)膜能夠促進(jìn)自體松質(zhì)骨修復(fù)骨缺損，在兩端骨髓腔封閉的情況下它能否為滅活移植骨提供必需的細(xì)胞、血供及生長因

5、子修復(fù)骨缺損尚不清楚，同時(shí)誘導(dǎo)膜中生長因子含量隨時(shí)間的變化情況亦不明確，這對(duì)二期植骨時(shí)間的選擇具有重要指導(dǎo)意義，誘導(dǎo)膜與骨膜促成骨活性的異同還有待研究。
　　本研究通過在動(dòng)物體內(nèi)建立骨缺損-誘導(dǎo)膜模型，在封閉的誘導(dǎo)膜內(nèi)植入滅活自體移植骨材料以期修復(fù)骨缺損，進(jìn)而在不同時(shí)間點(diǎn)取出誘導(dǎo)膜、骨膜組織，觀察誘導(dǎo)膜的結(jié)構(gòu)、生長因子含量隨時(shí)間的變化情況，同時(shí)將不同時(shí)間點(diǎn)的誘導(dǎo)膜及骨膜蛋白提取液在體外與間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，觀察干細(xì)胞增值、分化情

6、況，從而與骨膜進(jìn)行比較，初步探討誘導(dǎo)膜促進(jìn)滅活自體骨成骨的機(jī)制。
　　二、研究目的
　　1、構(gòu)建兔骨缺損誘導(dǎo)膜模型，膜內(nèi)植入滅活骨觀察誘導(dǎo)膜能否促進(jìn)滅活移植骨修復(fù)骨缺損;2、通過組織切片染色及ELISA蛋白定量分析誘導(dǎo)膜主要生長因子隨時(shí)間的變化情況，以尋找最佳植骨時(shí)間;3、提取誘導(dǎo)膜和骨膜的蛋白液與間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)比較它們的促成骨能力。
　　三、材料和方法
　　1.第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供新西蘭大白兔24只，

7、雌雄不限，體重(2.35±0.12)kg，實(shí)驗(yàn)兔一期在雙側(cè)橈骨中段制造1.5cm骨缺損，隨后填塞聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)骨水泥誘導(dǎo)生物膜形成，6周取出骨水泥進(jìn)行二期處理，按隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、模型組和對(duì)照組，并根據(jù)分組進(jìn)行不同的處理，每組8只。實(shí)驗(yàn)組保留誘導(dǎo)膜并在誘導(dǎo)膜內(nèi)植入經(jīng)高溫水浴滅活(100℃30min)的自體松質(zhì)骨，模型組保留誘導(dǎo)膜不植骨，對(duì)照組小心去除誘導(dǎo)膜后植入自體滅活骨(100℃30min)。常規(guī)條件飼

8、養(yǎng)8、12周后通過放射學(xué)檢測和組織學(xué)檢測評(píng)估新生骨形成情況。
　　2.健康成年新西蘭大白兔32只，在動(dòng)物手術(shù)室無菌條件下將新西蘭大白兔雙側(cè)橈骨制造1.5cm骨缺損，同期植入聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)骨水泥2g，縫合手術(shù)切口，常規(guī)條件下飼養(yǎng)。2、4、6、8周后取出骨水泥，仔細(xì)分離周圍包裹的誘導(dǎo)膜，同時(shí)分離正常骨膜(Peristeum)以及肌外膜(Epimysium)進(jìn)行比較，不同時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)膜組織、骨膜、肌外膜具體檢測項(xiàng)目如下：①將

9、三種膜組織用甲醛固定后行HE染色，觀察誘導(dǎo)膜組織結(jié)構(gòu)隨時(shí)間變化情況并與骨膜作比較。②提取膜蛋白組織進(jìn)行ELISA檢測血管內(nèi)皮生長因子Vascularendothelialgrowthfactor(VEGF)，血管緊張素-2AngiotensinⅡ(ANGⅡ)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2Bonemorphogeneticprotein2(BMP2)，成纖維生長因子-2Fibroblastgrowthfactor2(FGF2)，前列腺素E2pros

10、taglandinE2(PGE2)含量及其隨時(shí)間的變化情況，③提取膜組織蛋白液與間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)，檢測干細(xì)胞增殖和分化，同時(shí)嘗試分離鑒定誘導(dǎo)膜中貼壁生長細(xì)胞。
　　四、結(jié)果
　　1.實(shí)驗(yàn)兔骨缺損重建模型放射學(xué)檢測可見二期處理后第8周、12周實(shí)驗(yàn)組中新生骨形成明顯優(yōu)于對(duì)照組和模型組(P＜0.01)，模型組可見少許骨痂形成，對(duì)照組未見新生骨形成;第8、12周組織學(xué)切片中觀察實(shí)驗(yàn)組可見軟骨細(xì)胞形成和骨細(xì)胞，成骨明顯優(yōu)于模型組和對(duì)照

11、組(P＜0.01)，對(duì)照組僅可觀察到纖維連接，未見骨性連接和骨細(xì)胞。
　　2.組織切片HE染色結(jié)果顯示誘導(dǎo)膜和骨膜均含有分界明顯的兩層，內(nèi)層含豐富的血管組織，外層為成纖維和膠原層，2周誘導(dǎo)膜組織水腫明顯，中性粒細(xì)胞多，炎癥反應(yīng)最明顯，血管最豐富，4周后誘導(dǎo)膜的厚度以及血管含量隨時(shí)間逐漸減小并趨于成熟，同時(shí)在誘導(dǎo)膜切片HE染色中觀察到軟骨內(nèi)骨化。
　　3.三種膜蛋白提取液ELISA檢測結(jié)果顯示肌外膜中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各種蛋白含量均較

12、低，誘導(dǎo)膜中的BMP-2、VEGF含量第6周達(dá)到高峰，在第6周誘導(dǎo)膜BMP-2的含量高于骨膜(P＜0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)跟骨膜接近。6周誘導(dǎo)膜中VEGF含量接近骨膜，其余時(shí)間點(diǎn)均低于骨膜。誘導(dǎo)膜中FGF2、ANG-Ⅱ在第4周達(dá)到高峰后開始下降，骨膜中FGF-2一直處于較高水平，在4周和誘導(dǎo)膜含量接近，誘導(dǎo)膜中ANG-Ⅱ一直高于骨膜和肌外膜，肌外膜和骨膜ANG-Ⅱ沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。檢測發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)膜中PGE2的含量隨時(shí)間改變沒有

13、明顯的變化，誘導(dǎo)膜與骨膜和肌外膜之間也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)
　　4.三種膜標(biāo)本對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明間充質(zhì)干細(xì)胞在肌外膜蛋白提取液的培養(yǎng)基中一直處于較低增殖水平，第2、8周誘導(dǎo)膜促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力跟骨膜接近(P＞0.05)，第4、6周誘導(dǎo)膜刺激細(xì)胞增殖能力大于骨膜(P＜0.05)，間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化通過檢測堿性磷酸酶活性來評(píng)價(jià)。結(jié)果表明第2、8周誘導(dǎo)膜蛋白提取液促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化方面低于骨膜(P＜0.

14、05)，在第4、6周誘導(dǎo)膜和骨膜培養(yǎng)基中ALP活性接近，第4、6周誘導(dǎo)膜促進(jìn)干細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)，同時(shí)第4周誘導(dǎo)膜ALP活性高于其他時(shí)間點(diǎn)。骨膜和成熟誘導(dǎo)膜對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化促進(jìn)作用相當(dāng)。我們分離培養(yǎng)得到CD44+貼壁細(xì)胞在誘導(dǎo)劑條件下能向成骨方向分化，
　　五、結(jié)論
　　1.誘導(dǎo)膜在植入骨水泥后4-6周主要成骨相關(guān)生長因子含量最高，成骨能力最強(qiáng)，此時(shí)是最佳的植骨時(shí)間;2.誘導(dǎo)膜生長因子含量及促成骨活性與骨膜接近;3