誘導膜活化滅活自體骨修復骨缺損的實驗研究.pdf

1、一、研究背景:
　　近年來，四肢大段骨缺損的修復重建取得了巨大進步，但仍然是困擾骨科醫(yī)生的主要難題之一，理想的治療目標不僅要實現(xiàn)骨缺損的快速愈合，同時要減少對患者的不利影響，最后恢復患肢的功能。目前經(jīng)典的重建方法包括自體松質(zhì)骨移植，Ilizarov技術以及帶血管腓骨移植技術，這些方法在四肢骨缺損修復重建過程中取得了巨大的成功，至今仍發(fā)揮著不可或缺的作用，但這幾種骨重建技術存在一定的局限性仍需要改進。自體松質(zhì)骨移植僅適用于修復4-6

2、cm以內(nèi)的骨缺損，否則移植骨可能被吸收導致骨重建失敗。骨搬移技術治療周期較長，患肢佩戴大體積的外固定架對患者的日常生活影響較大，治療過程極為痛苦，患者不易耐受。帶血管腓骨移植技術對修復大段骨缺損具有一定優(yōu)勢，但是對設備和技術要求較高，還容易出現(xiàn)骨連接不正、骨延遲愈合或不愈合、供骨區(qū)和受骨區(qū)同時失敗的風險和并發(fā)癥[1-3]。2000年Masquelet等[4]報道了膜誘導技術治療四肢節(jié)段性骨缺損，因為具有成功率高、并發(fā)癥少、操作簡單等優(yōu)勢

3、逐步被越來越多的骨科醫(yī)師所認可。該技術治療骨缺損主要通過兩期手術完成，首先對骨缺損及周圍清創(chuàng)，去除感染、壞死的組織，局部填塞聚甲基丙烯酸甲酯(PolymethylMethacrylatePMMA)骨水泥誘導周圍形成一層具有生物活性的膜，稱為誘導膜，二期(6-8周后)在膜內(nèi)植入顆粒狀自體松質(zhì)骨修復骨缺損。早期研究顯示該技術修復骨缺損成功率高達88％～100％，能夠成功修復長達25cm的骨缺損[5-7]。目前認為膜誘導技術治療四肢骨缺損成功

4、率高的關鍵因素是骨水泥誘導形成的生物膜，它不僅能維持移植骨的形態(tài)，防止移植骨被周圍組織吸收，同時能為移植骨成骨提供必須的血供及多種成骨生長因子，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2）、血管內(nèi)皮生長因子（Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）等[5]。誘導膜能夠促進自體松質(zhì)骨修復骨缺損，在兩端骨髓腔封閉的情況下它能否為滅活移植骨提供必需的細胞、血供及生長因

5、子修復骨缺損尚不清楚，同時誘導膜中生長因子含量隨時間的變化情況亦不明確，這對二期植骨時間的選擇具有重要指導意義，誘導膜與骨膜促成骨活性的異同還有待研究。
　　本研究通過在動物體內(nèi)建立骨缺損-誘導膜模型，在封閉的誘導膜內(nèi)植入滅活自體移植骨材料以期修復骨缺損，進而在不同時間點取出誘導膜、骨膜組織，觀察誘導膜的結(jié)構、生長因子含量隨時間的變化情況，同時將不同時間點的誘導膜及骨膜蛋白提取液在體外與間充質(zhì)干細胞進行培養(yǎng)，觀察干細胞增值、分化情

6、況，從而與骨膜進行比較，初步探討誘導膜促進滅活自體骨成骨的機制。
　　二、研究目的
　　1、構建兔骨缺損誘導膜模型，膜內(nèi)植入滅活骨觀察誘導膜能否促進滅活移植骨修復骨缺損;2、通過組織切片染色及ELISA蛋白定量分析誘導膜主要生長因子隨時間的變化情況，以尋找最佳植骨時間;3、提取誘導膜和骨膜的蛋白液與間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)比較它們的促成骨能力。
　　三、材料和方法
　　1.第三軍醫(yī)大學動物實驗中心提供新西蘭大白兔24只，

7、雌雄不限，體重(2.35±0.12)kg，實驗兔一期在雙側(cè)橈骨中段制造1.5cm骨缺損，隨后填塞聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)骨水泥誘導生物膜形成，6周取出骨水泥進行二期處理，按隨機數(shù)字表法將實驗兔隨機分為實驗組、模型組和對照組，并根據(jù)分組進行不同的處理，每組8只。實驗組保留誘導膜并在誘導膜內(nèi)植入經(jīng)高溫水浴滅活(100℃30min)的自體松質(zhì)骨，模型組保留誘導膜不植骨，對照組小心去除誘導膜后植入自體滅活骨(100℃30min)。常規(guī)條件飼

8、養(yǎng)8、12周后通過放射學檢測和組織學檢測評估新生骨形成情況。
　　2.健康成年新西蘭大白兔32只，在動物手術室無菌條件下將新西蘭大白兔雙側(cè)橈骨制造1.5cm骨缺損，同期植入聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)骨水泥2g，縫合手術切口，常規(guī)條件下飼養(yǎng)。2、4、6、8周后取出骨水泥，仔細分離周圍包裹的誘導膜，同時分離正常骨膜(Peristeum)以及肌外膜(Epimysium)進行比較，不同時間點誘導膜組織、骨膜、肌外膜具體檢測項目如下：①將

9、三種膜組織用甲醛固定后行HE染色，觀察誘導膜組織結(jié)構隨時間變化情況并與骨膜作比較。②提取膜蛋白組織進行ELISA檢測血管內(nèi)皮生長因子Vascularendothelialgrowthfactor(VEGF)，血管緊張素-2AngiotensinⅡ(ANGⅡ)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2Bonemorphogeneticprotein2(BMP2)，成纖維生長因子-2Fibroblastgrowthfactor2(FGF2)，前列腺素E2pros

10、taglandinE2(PGE2)含量及其隨時間的變化情況，③提取膜組織蛋白液與間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)，檢測干細胞增殖和分化，同時嘗試分離鑒定誘導膜中貼壁生長細胞。
　　四、結(jié)果
　　1.實驗兔骨缺損重建模型放射學檢測可見二期處理后第8周、12周實驗組中新生骨形成明顯優(yōu)于對照組和模型組(P＜0.01)，模型組可見少許骨痂形成，對照組未見新生骨形成;第8、12周組織學切片中觀察實驗組可見軟骨細胞形成和骨細胞，成骨明顯優(yōu)于模型組和對照

11、組(P＜0.01)，對照組僅可觀察到纖維連接，未見骨性連接和骨細胞。
　　2.組織切片HE染色結(jié)果顯示誘導膜和骨膜均含有分界明顯的兩層，內(nèi)層含豐富的血管組織，外層為成纖維和膠原層，2周誘導膜組織水腫明顯，中性粒細胞多，炎癥反應最明顯，血管最豐富，4周后誘導膜的厚度以及血管含量隨時間逐漸減小并趨于成熟，同時在誘導膜切片HE染色中觀察到軟骨內(nèi)骨化。
　　3.三種膜蛋白提取液ELISA檢測結(jié)果顯示肌外膜中每個時間點各種蛋白含量均較

12、低，誘導膜中的BMP-2、VEGF含量第6周達到高峰，在第6周誘導膜BMP-2的含量高于骨膜(P＜0.05)，其余時間點跟骨膜接近。6周誘導膜中VEGF含量接近骨膜，其余時間點均低于骨膜。誘導膜中FGF2、ANG-Ⅱ在第4周達到高峰后開始下降，骨膜中FGF-2一直處于較高水平，在4周和誘導膜含量接近，誘導膜中ANG-Ⅱ一直高于骨膜和肌外膜，肌外膜和骨膜ANG-Ⅱ沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。檢測發(fā)現(xiàn)誘導膜中PGE2的含量隨時間改變沒有

13、明顯的變化，誘導膜與骨膜和肌外膜之間也無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)
　　4.三種膜標本對間充質(zhì)干細胞增殖實驗結(jié)果表明間充質(zhì)干細胞在肌外膜蛋白提取液的培養(yǎng)基中一直處于較低增殖水平，第2、8周誘導膜促進間充質(zhì)干細胞增殖能力跟骨膜接近(P＞0.05)，第4、6周誘導膜刺激細胞增殖能力大于骨膜(P＜0.05)，間充質(zhì)干細胞成骨分化通過檢測堿性磷酸酶活性來評價。結(jié)果表明第2、8周誘導膜蛋白提取液促進間充質(zhì)干細胞成骨分化方面低于骨膜(P＜0.

14、05)，在第4、6周誘導膜和骨膜培養(yǎng)基中ALP活性接近，第4、6周誘導膜促進干細胞增殖作用最強，同時第4周誘導膜ALP活性高于其他時間點。骨膜和成熟誘導膜對間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化促進作用相當。我們分離培養(yǎng)得到CD44+貼壁細胞在誘導劑條件下能向成骨方向分化，
　　五、結(jié)論
　　1.誘導膜在植入骨水泥后4-6周主要成骨相關生長因子含量最高，成骨能力最強，此時是最佳的植骨時間;2.誘導膜生長因子含量及促成骨活性與骨膜接近;3