EphB信號在軸向仿生壓應力調控MSC成骨分化中的作用和機制研究.pdf

1、目的：
　　臨床實踐和實驗室研究表明，不同強度的壓應力對骨的生理、病理活動產(chǎn)生不同的影響，但遠未能闡明其機制。因此，深入研究壓應力調控骨組織生理、病理活動的分子機制，尋找壓應力促進或抑制成骨的轉化條件，對臨床上正確運用壓應力具有重要的指導意義，并有望為探索骨傷病的療法提供新思路。由于體內力學環(huán)境和生化環(huán)境過于復雜，難以得出可重復的結果，該領域的研究多采用體外應力環(huán)境。目前的商品化或自制的生物反應器普遍不能提供精確的仿生應力環(huán)境，也

2、難以提供長期穩(wěn)定的培養(yǎng)基生化環(huán)境，成為該研究領域的技術瓶頸。肝配蛋白ephrin及其受體Eph(ephrinreceptor)家族近年來被發(fā)現(xiàn)參與了骨骼發(fā)育、重塑和骨相關疾病的調控，可能成為我們深入認識應力調控骨生理、病理活動機制的新線索。本研究采用反饋調節(jié)的設計思路，制作了一款可以為粘彈性生物材料和組織提供精確拉伸應力和壓應力的新型生物反應器，以此為基礎研究了體外三維仿生培養(yǎng)環(huán)境中間充質干細胞(mesenchymal stemcell

3、，MSC)成骨分化的調控因素，以及EphB4、B6參與力學、化學信號轉化并調控MSC成骨分化的機制。
　　方法：
　　1、本研究著重改進生物反應器的施力功能，在施力裝置中整合柔性元件，用于施力器和組織之間的拉、壓應力傳遞，消除剛性接觸導致的應力突變、瞬態(tài)過沖。根據(jù)脛骨平臺下松質骨與跟腱的受力模型編寫仿生應力控制軟件，為新型施力裝置提供反饋控制環(huán)路。改進培養(yǎng)基生化環(huán)境控制系統(tǒng)，包括中空纖維半透膜重新選材，優(yōu)化了物質交換器內部液

4、流途徑，優(yōu)化pH、PO2、PCO2的控制程序。
　　2、將組織工程骨分為靜置培養(yǎng)、單純應力培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)三組，以檢測生物反應器的仿生應力環(huán)境和生化環(huán)境對三維培養(yǎng)細胞的影響。
　　3、用PCR檢測MSC成骨分化后的ephrin、Eph家族表達變化，確定EphB6為主要研究對象后，通過配體激活、siRNA、過表達研究其對MSC成骨分化的調控作用。為了解EphB6的下游信號，檢測RhoA磷酸化水平，并用ROCK抑制劑阻斷RhoA-

5、ROCK通路。
　　4、在生物反應器工作參數(shù)中明確定義適度壓應力、過度壓應力，用免疫共沉淀、激光共聚焦研究EphB4、EphB6與整合素β亞基是否發(fā)生聯(lián)系，用免疫共沉淀檢測EphB與整合素β亞基是否與其他蛋白形成復合體。用生物信息學技術預測EphB與整合素β亞基是否有直接接觸及可能的結合位點。
　　結果：
　　1、在施力裝置中整合柔性元件，實現(xiàn)對具有粘彈性的組織和生物材料均勻、穩(wěn)定施力。通過有限元技術獲得人體組織承受生

6、物應力的仿生模型，并以此為依據(jù)編寫了仿生應力控制軟件。同時改進物質交換系統(tǒng)，使培養(yǎng)基的生化指標在預設的范圍內長期保持穩(wěn)定。
　　2、改進后的生物反應器能促進組織工程骨中的MSC增殖和成骨分化。在仿生壓應力的作用下，三維支架里的細胞排列有序，細胞骨架伸展方向一致，表明該生物反應器能夠為組織工程骨提供三維應力環(huán)境，為后繼實驗奠定了基礎。
　　3、定量PCR和免疫熒光染色表明EphB6在MSC成骨分化時表達下調。EphB6與配體e

7、phrinB1結合后使ALP活性和Runx2表達降低。siRNA沉默EphB6使MSC的Runx2表達上調，ALP活性增高，鈣結節(jié)染色增強，而過表達EphB6則出現(xiàn)相反的結果。但上述基因操作均不會影響MSC的成軟骨分化和成脂肪分化。
　　4、RhoA的磷酸化水平與成骨分化呈負相關，受到EphB6 siRNA干擾的細胞在成骨誘導培養(yǎng)第7天有更多GTP-RhoA，而過表達的細胞則顯著減少。在MSC成骨誘導培養(yǎng)基中添加ROCK抑制劑Y-

8、27632，發(fā)現(xiàn)Runx2的表達上調，在siRNA干擾和過表達EphB6的細胞中也同樣檢測到Runx2的表達上調。
　　5、本研究在自制的生物反應器上將0.5Hz、峰值10％形變的仿生壓應力定義為適度壓應力，0.5Hz、峰值20％形變的仿生壓應力將過度壓應力，并證實適度壓應力下組織工程骨的ALP活性和Runx2表達增強，能促進MSC成骨分化，而過度壓應力則會抑制MSC成骨分化。由此為后續(xù)研究確立了力學標準。
　　6、在適度壓

9、應力下，EphB4與整合素β1形成免疫共沉淀，過度壓應力下EphB6與整合素β3形成免疫共沉淀。激光共聚焦觀察到，適度壓應力下EphB4與整合素β1共同分布在細胞膜的部分區(qū)域，并且被募集到F-actin的起始端。而EphB6則在過度壓應力下與整合素β3共同分布在細胞膜上，且募集到F-actin的起始端。
　　7、FAK、Vinculin和Paxilin在適度壓應力和過度壓應力下均與EphB4形成了免疫共沉淀，但不與EphB6發(fā)生聯(lián)

10、系。
　　8、生物信息學分析預測EphB與整合素β亞基可能有直接聯(lián)系。EphB6可能的結合位點序列是230-290、362-393、555-580、610-635，整合素β3可能的結合位點序列是189-204、284-313。
　　結論：
　　1、該新型生物反應器配合仿生應力控制軟件和物質交換系統(tǒng)，能夠為組織和三維生物材料提供精確仿生的應力培養(yǎng)環(huán)境。
　　2、EphB6抑制MSC成骨分化，可能是通過提高RhoA磷

11、酸化水平來發(fā)揮作用的。沉默表達或過表達EphB6基因操作均不會影響MSC的成軟骨分化和成脂肪分化，可見EphB6是特異性地抑制MSC的成骨分化能力，而不是弱化其分化潛能。
　　3、本研究在自制的生物反應器上定義了適度壓應力和過度壓應力，為后續(xù)研究確立了力學標準。發(fā)現(xiàn)在不同強度壓應力下EphB4、B6分別與整合素β1、β3發(fā)生聯(lián)系，且EphB4、B6被募集到F-actin的起始端。由此推測，在應力環(huán)境下，整合素與F-actin（即細