EMMPRIN在肺癌介導(dǎo)的抑制成骨分化過(guò)程中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　肺癌是當(dāng)今全球癌癥死亡的主要原因之一。根據(jù)生物學(xué)特點(diǎn)、治療方式及預(yù)后等可將肺癌主要分為兩大類(lèi):非小細(xì)胞肺癌與小細(xì)胞肺癌，其中以非小細(xì)胞肺癌為主。非小細(xì)胞肺癌占85％以上，而其中約30％-40％的非小細(xì)胞肺癌患者會(huì)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。目前對(duì)于肺癌骨轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究并不清楚。研究比較深入的為“惡性循環(huán)”學(xué)說(shuō)，一方面，轉(zhuǎn)移至骨的腫瘤細(xì)胞表達(dá)、分泌眾多細(xì)胞因子，作用于骨微環(huán)境，破壞了成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收之間的正常生

2、理平衡;另一方面，骨質(zhì)的破壞也會(huì)釋放一系列因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲等。肺癌骨轉(zhuǎn)移可導(dǎo)致一系列包括骨痛、病理性骨折、脊髓壓迫和神經(jīng)壓迫癥狀等在內(nèi)的嚴(yán)重并發(fā)癥，降低患者的生活質(zhì)量。
　　細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(Extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN)，又稱(chēng)CD147，是一種高度糖基化的跨膜糖蛋白，為免疫球蛋白超家族一員，能刺激多種基質(zhì)金屬蛋白酶（Matr

3、ix metallo proteinases，MMPs）的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移，并能夠通過(guò)調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growthfactor, VEGF)的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤血管生成。業(yè)已證實(shí)，EMMPIN的高表達(dá)與乳腺癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。最近有文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)上調(diào)EMMPRIN的表達(dá)，可加速“惡性循環(huán)”，激活破骨細(xì)胞，增強(qiáng)乳腺癌的溶骨性轉(zhuǎn)移，但EMMPRIN

4、對(duì)肺癌細(xì)胞介導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化成熟是否起作用并不清楚。
　　本研究旨在研究EMMPRIN在肺癌介導(dǎo)的抑制成骨分化中的作用及可能機(jī)制，為臨床肺癌骨轉(zhuǎn)移防治開(kāi)辟新的思路。
　　方法:
　　我們采用EMMPRIN過(guò)表達(dá)、短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒感染非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，建立穩(wěn)定的相應(yīng)A549細(xì)胞系。首先，觀(guān)察其對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞自身的增殖、遷移與侵襲等生物學(xué)行為的影響，并

5、探討其可能機(jī)制。而后，收集相應(yīng)的肺癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基(conditioned medium，CM)，與成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1共培養(yǎng)，觀(guān)察其對(duì)成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1成骨分化的影響。最后，我們檢測(cè)其對(duì)肺癌A549細(xì)胞自身的DKK1的表達(dá)的影響，并進(jìn)一步檢測(cè)成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路β-catenin活化的情況。
　　一、EMMPRIN對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響
　　1

6、.用shRNA干擾EMMPRIN表達(dá)的慢病毒、過(guò)表達(dá)EMMPRIN的慢病毒及陰性對(duì)照(negative control，NC)的慢病毒感染肺癌A549細(xì)胞，嘌呤霉素篩選。利用RealtimePCR技術(shù)、Western-blot蛋白印跡法分別檢測(cè)各組細(xì)胞EMMPRIN的mRNA、蛋白表達(dá)情況。建立穩(wěn)定EMMPRIN過(guò)表達(dá)(A549EMP)、干擾EMMPRIN表達(dá)(A549shEMP)和陰性對(duì)照A549NC細(xì)胞。采用CCK-8實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)

7、及Transwell小室法分別檢測(cè)EMMPRIN對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力的影響。
　　2.利用Western-blot蛋白印跡法檢測(cè)A549EMP細(xì)胞、A549shEMP細(xì)胞、A549NC細(xì)胞與空白對(duì)照A549細(xì)胞中的β-catenin核表達(dá)情況。
　　二、EMMPRIN在肺癌介導(dǎo)的抑制成骨分化中的作用機(jī)制研究
　　收集A549EMP細(xì)胞、A549shEMP細(xì)胞、A549NC細(xì)胞與空白對(duì)照A549細(xì)胞條件

8、培養(yǎng)基，以20％條件培養(yǎng)基的含量制備相應(yīng)不同組成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并與成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1共培養(yǎng)。
　　1.利用BCIP/NBT染色法檢測(cè)相應(yīng)各組MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性;
　　2.利用茜素紅S染色檢測(cè)相應(yīng)各組MC3T3-E1細(xì)胞骨結(jié)節(jié)礦化形成情況;
　　3.利用realtime PCR技術(shù)檢測(cè)相應(yīng)各組MC3T3-E1細(xì)胞Collα1、RUNX2/Cbfa1和OCN mRNA的相對(duì)表達(dá)量;
　　4.利用

9、realtime PCR技術(shù)、Western-blot蛋白印跡法及細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)相應(yīng)各組肺癌A549細(xì)胞DKK1表達(dá)的差異情況;
　　5.利用Western-blot蛋白印跡法檢測(cè)相應(yīng)各組MC3T3-E1細(xì)胞中的β-catenin核表達(dá)的差異情況。
　　結(jié)果:
　　一、EMMPRIN對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力的影響
　　1.穩(wěn)定的肺癌A549細(xì)胞系的成功建立與A549NC組、空白對(duì)照A549組相比

10、，A549EMP組細(xì)胞EMMPRIN的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P＜0.05)，相反，A549shEMP組細(xì)胞的EMMPRIN的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P＜0.05);A549NC組與空白對(duì)照A549組相比，EMMPRIN mRNA和蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　2.EMMPRIN可增強(qiáng)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的能力
　　1)與空白對(duì)照A549組相比，A549EMP組細(xì)胞增殖、遷移與

11、侵襲能力明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，而A549shEMP組細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力能力明顯降低（P＜0.05）.
　　2)上調(diào)EMMPRIN的表達(dá)，可明顯促進(jìn)A549細(xì)胞β-catenin核表達(dá)，反之下調(diào)EMMPRIN的表達(dá)，可明顯抑制A549細(xì)胞β-catenin核表達(dá);
　　二、EMMPRIN在肺癌介導(dǎo)的抑制成骨分化中作用機(jī)制的研究
　　1.干擾EMMPRIN表達(dá)可減弱肺癌A549細(xì)胞條件培養(yǎng)基(CM)介導(dǎo)的抑制成骨

12、分化的能力:
　　1) ALP活性:與陽(yáng)性對(duì)照組相比，A549shEMPCM組、A549NCCM組及A549CM組MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性均明顯減弱;而相比于A(yíng)549CM組，A549shEMPCM組MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性明顯增強(qiáng)，A549NCCM組ALP活性無(wú)明顯差異。
　　2)礦化:與陽(yáng)性對(duì)照組相比，A549shEMPCM組、A549NCCM組及A549CM組MC3T3-E1細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量、面積明顯減小;而

13、相比于A(yíng)549CM組，A549shEMPCM組MC3T3-E1細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量、面積明顯增大(P＜0.05)，A549NCCM組MC3T3-E1細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量、面積無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　3)成骨相關(guān)基因表達(dá):與陽(yáng)性對(duì)照組相比，A549shEMPCM組、A549NCCM組及A549CM組MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化相關(guān)標(biāo)志基因Col1α1、RUNX2/Cbfa1和OCNmRNA表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05);而相比于

14、A549CM組，A549shEMPCM組MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化相關(guān)標(biāo)志基因Col1α1、RUNX2/Cbfa1和OCN mRNA表達(dá)水平明顯增高(P＜0.05），A549NCCM組MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化相關(guān)標(biāo)志基因Col1α1、RUNX2/Cbfa1和OCN mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　2.EMMPRIN可通過(guò)影響肺癌A549細(xì)胞DKK1的表達(dá)，影響成骨前體細(xì)胞β-catenin的活化，參與肺癌A

15、549條細(xì)胞件培養(yǎng)基(CM)介導(dǎo)的成骨抑制作用
　　1)DKK1的表達(dá):干擾EMMPRIN的表達(dá)可顯著下調(diào)肺癌A549條細(xì)胞及肺癌A549條件培養(yǎng)基中DKK1的mRNA和蛋白水平(P＜0.05），相反，過(guò)表達(dá)EMMPRIN可顯著上調(diào)肺癌A549條細(xì)胞及肺癌A549條件培養(yǎng)基中DKK1的mRNA和蛋白水平(P＜0.05);
　　2)MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)β-catenin核表達(dá):
　　A549shEMPCM組、A549N

16、CCM組及A549CM組MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)β-catenin核表達(dá)水平明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.05)，而相比于A(yíng)549CM組，A549shEMPCM組MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)β-catenin核表達(dá)水平明顯增高(P＜0.05);A549EMPCM組MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)β-catenin核表達(dá)水平與A549shEMPCM組剛好相反，即相比于A(yíng)549CM組，A549EMPCM組成骨前體細(xì)胞內(nèi)β-catenin核表達(dá)水平明顯增高(P＜