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文檔簡介
1、目的:體外誘導(dǎo)NSCs并使NSCs分化為NPCs,觀察NSCs及NPCs在發(fā)育過程中NMDARs(NMDA受體)介導(dǎo)的全細(xì)胞電流的變化情況,以及Na+、Ca2+電流出現(xiàn)的先后順序,為作用于NMDARs促進(jìn)NSCs分化為NPCs的藥物提供一定的實驗依據(jù)。
方法:應(yīng)用細(xì)胞免疫化學(xué)方法觀察神經(jīng)干細(xì)胞Nestin以及分化1d、3d、7d、9dNPCs的βⅢ-tubulin表達(dá)情況。應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)在-60mv鉗制電壓下記錄NS
2、Cs和NPCs電流。將NSCs和NPCs和分為對照組和實驗組觀察NSCs的NMDARs介導(dǎo)的電流變化以及NPCs分化1d、3d、5d、7d、9d時NMDARs介導(dǎo)的電流變化。對照組加入無Mg2+的配制20μM CNQX(AMPA和KA受體阻斷劑)沖洗細(xì)胞20s后立即加入無Mg2+的細(xì)胞外液;實驗組先加入用無Mg2+細(xì)胞外液配制20μM CNQX(AMPA和KA受體阻斷劑)沖洗細(xì)胞20s后立即加入用無Mg2+細(xì)胞外液配制的10μM、20μ
3、M、50μM、100μMNMDA,觀察NMDARs介導(dǎo)電流的變化情況。當(dāng)觀察Na+、Ca2+電流出現(xiàn)的先后順序時,(A)全電流組:先加入用無Mg2+細(xì)胞外液配制的20μMCNQX沖洗20s后立即加入用無Mg2+細(xì)胞外液配制100μMNMDA;(B)無Na+組:先用無Mg2+的NMDG(替代等摩爾量的Na+)細(xì)胞外液配制的20uMCNQX沖洗細(xì)胞20s后立即加入無Mg2+的NMDG細(xì)胞外液配制的100μMNMDA;(C)無Ca2+組,先用
4、無Mg2+的EGTA(螯合細(xì)胞外液的Ca2+)細(xì)胞外液配制的20μMCNQX沖洗細(xì)胞20s后,加入無Mg2+的EGTA細(xì)胞外液配制的100μMNMDA;(D)無Na+、Ca2+組,先用無Mg2+的無Na+、無Ca2+細(xì)胞外液配制的CNQX20μM沖洗細(xì)胞20S,后加入用無Mg2+的無Na、無Ca2+細(xì)胞外液配制的100μM NMDA,觀察電流變化。
結(jié)果:1.免疫細(xì)胸化學(xué)方法觀察到NSCs的Nesting為陽性,1d、7d
5、、9d的NPSs的βⅢ-tubulin為陽性。
2.未檢測到NSCs的NMDARs介導(dǎo)電流產(chǎn)生3.在不同分化時間的NPCs中,分化1d和2d的NPCs未檢測到電流。
3.分化3d、5d、7d、9d的NPCs時對照組未檢測到電流,實驗組檢測到電流,分化相同天數(shù)的NPCs隨劑量增加電流增大,p<0.05;加入相同、劑量的NMDA,隨著時間的進(jìn)行電流增大,p<0.05。
4.檢測分化3dNPCs的NM
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