NMDA受體信號通路在暈動癥適應-脫適應過程中的作用及機制.pdf

1、暈動癥是由于人體暴露于異常加速度環(huán)境所引起的多系統(tǒng)生理反應。反復暴露于該加速度環(huán)境，能使得暈動癥癥狀減輕甚至消失，這就是適應現象。脫離加速度環(huán)境一定時間后，會出現脫適應現象。但是這種適應脫適應的周期性規(guī)律和其中樞機制卻不清楚。眾所周知，前庭系統(tǒng)是外界加速度信息的主要感受系統(tǒng)，前人的研究發(fā)現在前庭神經元中，谷氨酸是主要的神經遞質，而NMDA受體也廣泛地存在于前庭核的神經元中。大量的研究表明，NMDA受體介導的長時程增強是中樞學習記憶的神經

2、基礎，NMDA受體介導的胞內信號轉導級聯反應主要是通過谷氨酸激活NMDA受體后通過鈣/鈣調蛋白依賴型激酶Ⅱ(Ca2+/CaMKⅡ)途徑，最終激活cAMP反應元件結合蛋白(CREB)，而磷酸化的CREB也作為轉錄因子可進一步誘導及早基因c-fos以及腦源性神經生長因子(BDNF)等新基因的表達。我們的前期研究發(fā)現Fos蛋白能作為前庭核神經元激活的分子標志，并且谷氨酸能神經元前庭內臟投射通路能被旋轉刺激所激活。另外，大量研究證實，海馬是記憶

3、相關的重要腦區(qū)，前庭與海馬之間存在著廣泛的聯系，前庭系統(tǒng)的激活能影響海馬的功能和海馬相關的學習記憶能力。本研究首先觀察了暈動癥大鼠的行為學變化和適應-脫適應規(guī)律，進一步采用分子生物學方法觀察NMDA受體信號通路在暈動癥適應-脫適應過程中的變化，最后采用藥理學手段阻斷該信號通路，觀察對暈動癥適應-脫適應過程的影響。
　　 方法:
　　 一、暈動癥適應-脫適應動物模型的建立
　　 1、實驗動物及分組
　　 5

4、50只健康雄性SD大鼠，體重220-250g。
　　 (1)長時刺激實驗
　　 100只動物完全隨機分為10組：旋轉刺激4h組，靜止對照4h組，1h旋轉組，1h靜止組，2h旋轉組，2h靜止組，3h旋轉組，3h靜止組，4h旋轉組，4h靜止組，每組10只。前2組記錄每小時的實時行為學變化，后8組記錄自發(fā)活動變化。
　　 (2)東莨菪堿干預實驗
　　 90只動物完全隨機分為9組：自由活動對照組，靜止對照組，旋轉

5、對照組，東莨菪堿旋轉組Ⅰ(Sco0.5mg/kg)，東莨菪堿靜止組Ⅰ，東莨菪堿旋轉組Ⅱ(Sco1.0mg/kg)，東莨菪堿靜止組Ⅱ，溶劑旋轉組，溶劑靜止組，每組10只。藥物及溶劑組為刺激前30min給藥(1ml/只，i.g.)。
　　 (3)雙側迷路切除實驗
　　 40只動物完全隨機分為4組：雙側迷路切除旋轉組，雙側迷路切除靜止組，假手術旋轉組，假手術靜止組，每組10只。手術后4周進行刺激實驗。
　　 (4)適應

6、規(guī)律實驗
　　 40只動物完全隨機分為2組：旋轉刺激2h/d組、靜止對照2h/d組，每組20只，每天進行模擬暈動刺激，實時觀察行為學變化。
　　 100只動物完全隨機分為10組：旋轉刺激2h-1d組、2h-4d組、2h-7d組、2h-10d組、2h-13d組，和與各自時間對應的靜止對照組，每組10只，記錄自發(fā)活動變化。
　　 (5)脫適應規(guī)律實驗
　　 180只動物完全隨機分為18組：脫適應5d，7d，1

7、4d，21d，28d，35d組及相應天數刺激對照組，靜止對照組，每組10只。脫適應組動物首先進行暈動刺激至適應，連續(xù)9d，每天2h，后正常飼養(yǎng)至相應脫適應天數，再進行一次2h暈動刺激，記錄實時行為學變化和自發(fā)活動變化。
　　 2、雙側迷路切除手術及假手術
　　 3％戊巴比妥那麻醉后，將大鼠側臥位置于手術顯微鏡下，剪開耳后皮膚，鈍性分離軟組織，暴露外耳道外壁，剪開外耳道，暴露鼓膜及鼓室，觀察聽小骨清晰后，尋找圓窗及卵圓窗，

8、用五號注射器針頭挑開鼓泡，除去部分骨質，用尖頭鑷探查內耳，剪除內耳骨部，挑出內耳，用左氧氟沙星粉劑敷于內耳，防止感染，縫合外耳道及耳后部皮膚，存活24h后，重新進行另一側內耳切除手術。假手術過程與雙側內耳切除手術相同，區(qū)別在于剪除內耳骨部后，不觸及內耳半規(guī)管。動物正常飼養(yǎng)恢復4周后，進行旋轉刺激。
　　 3、模擬暈動癥刺激及行為學測量
　　 暈動癥模擬器根據Crampton等的報道仿制而成。將代謝盒放入暈動癥模擬器的有機

9、玻璃籠內，旋轉刺激組大鼠無束縛的放置于代謝盒的鐵絲網上進行旋轉刺激。
　　 實時行為學測量：刺激結束后，立即計量鐵絲網上的糞便顆粒數、尿液槽中的尿液量、飼料槽中飼料攝入量、高嶺土槽中高嶺土攝入量。高嶺土攝入量(24h)測量：每天10:00自動動物代謝監(jiān)測系統(tǒng)(CLAMS)自動記錄。自發(fā)活動測量：采用DigBehav動物行為分析系統(tǒng)記錄動物3min的運動。
　　 二、前庭核NMDA受體信號通路在暈動癥適應-脫適應過程中的作

10、用
　　 1、實驗動物及分組
　　 128只健康雄性SD大鼠，體重220-250g。80只動物完全隨機分為10組：旋轉刺激組1d，4d，7d，10d，13d及相應的靜止對照組，每組8只，用于進行westernblot和實時定量PCR實驗。48只動物完全隨機分為6組：旋轉刺激組1d，4d，7d，10d，13d及靜止對照組，每組8只，用于進行免疫組織化學及免疫熒光組織化學實驗。
　　 2、分子生物學實驗
　　

11、 采用Westernblot法測定尾側前庭核內NMDAR1受體、NMDAR2A/B受體、GABAAα1亞基、CaMKⅡα亞基、磷酸化CaMKⅡα亞基、CREB、磷酸化CREB蛋白含量。
　　 采用實時定量PCR法測定尾側前庭核內Fos、Arc、BDNFmRNA表達水平。
　　 采用免疫組織化學法觀察尾側前庭核內Fos標記神經元數量。
　　 采用免疫熒光組織化學法觀察尾側前庭核內GABAAα1標記神經元、Arc標記

12、神經元、GABAAα1/Arc共標記神經元數量。
　　 三、海馬NMDA受體信號通路在暈動癥適應-脫適應過程中的作用
　　 1、實驗動物及分組
　　 260只健康雄性SD大鼠，體重220-250g。80只動物完全隨機分為10組：旋轉刺激組1d，4d，7d，10d，13d及相應的靜止對照組，每組8只，用于進行westernblot和實時定量PCR實驗。30只動物完全隨機分為6組：脫適應組1d，4d，7d，14d，2

13、1d及靜止對照組(Sta)，每組5只，用于進行westernblot實驗。150只動物完全隨機分為15組：抑制劑組2d，4d，6d，8d，10d及相應生理鹽水對照組、脫適應對照組，每組10只。
　　 2、雙側海馬內微注射
　　 3％戊巴比妥那麻醉后，將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上，切開顱頂部皮膚，暴露前囟點，以前囟點為原點定位雙側海馬中心部(AP3.8mm；ML2.3mm；DV3.0mm)，打開顱骨，插入進樣導管，牙科水

14、泥固定導管于顱骨表面，左氧氟沙星粉劑敷于顱骨表面，縫合顱頂部皮膚，蓋上導管帽。后正常飼養(yǎng)7d，前3d每天腹腔注射1ml左氧氟沙星注射液防治感染。乙醚麻醉大鼠后，打開導管帽，以注射管將0.5μl20nmol/μlKN-93緩慢注射至海馬中心部，留針1min，緩慢拔針，蓋上導管帽。
　　 3、行為學實驗
　　 旋轉刺激同第一部分，所有動物首先進行連續(xù)9d，每天2h的暈動刺激至適應；抑制劑組與生理鹽水對照組動物每天雙側海馬內微

15、注射CaMKⅡ抑制劑KN-93或生理鹽水至相應脫適應天數后，進行2h暈動刺激記錄實時行為學變化及自發(fā)活動變化；脫適應對照組正常飼養(yǎng)至相應脫適應天數后，進行2h暈動刺激記錄實時行為學變化及自發(fā)活動變化。
　　 4、分子生物學實驗
　　 采用Westernblot法測定海馬內NMDAR1受體、NMDAR2A/B、CaMKⅡα亞基、磷酸化CaMKⅡα亞基、CREB、磷酸化CREB蛋白含量。采用實時定量熒光PCR法測定海馬內Fo

16、s、Arc、BDNFmRNA表達水平。
　　 四、統(tǒng)計學分析
　　 采用SPSSv13.0軟件進行統(tǒng)計分析。適應規(guī)律、脫適應規(guī)律、Westernblot及PCR實驗中，兩因素多水平方差分析用來統(tǒng)計整個處理過程中旋轉刺激、時間的主因素效應和交互作用效應有無顯著性差異。當交互效應存在的情況下，單因素方差分析及Bonferroni檢驗用來分析相對應的時間點，旋轉刺激組和靜止對照組之間的差異。
　　 行為學指標篩選實驗中

17、，方差分析Bonferroni檢驗用來分析相對應的時間點，旋轉刺激組和靜止對照組之間的差異。
　　 免疫組織化學及免疫熒光組織化學實驗中，單因素方差分析及Dunnett-t檢驗用來統(tǒng)計尾側前庭核中標記神經元數目有無差別。
　　 結果:
　　 一、暈動癥適應-脫適應動物模型的建立
　　 1、長時刺激對暈動癥行為學的影響
　　 統(tǒng)計分析顯示，與靜止對照組(Sta)相比，糞便顆粒數在刺激的第1、2小時增

18、加(P<0.05)，在第3、4小時下降至對照水平(P>0.05)：自發(fā)活動量和活動次數均在第1、2小時降低(P<0.05)，在第3、4小時上升到接近對照組水平(P>0.05)：24h高嶺土攝入量在4h中均增加(P<0.05)。尿液量無顯著變化(P>0.05)。
　　 2、東莨菪堿對暈動癥行為學的影響
　　 統(tǒng)計分析顯示，與溶劑組相比，給予東莨菪堿0.5mg/kg和1.0mg/kg后，兩個劑量均可以減少糞便顆粒數與24h高

19、嶺土攝入量，增加自發(fā)活動量和活動次數(P<0.05)。由于灌胃給予溶液的原因，使得所有動物的尿液量均增加(P<0.05)。
　　 3、雙側內耳切除術對暈動癥行為學的影響
　　 統(tǒng)計分析顯示，雙側迷路切除組動物的糞便顆粒數、24h高嶺土攝入量、自發(fā)活動量和自發(fā)活動次數均與靜止對照組無明顯差別(P>0.05)，與暈動刺激對照組有差別(P<0.05)；假手術組動物各指標均與暈動刺激對照組無差別(P>0.05)。
　　

20、4、適應規(guī)律觀察實驗
　　 統(tǒng)計分析顯示暈動刺激組和靜止對照組動物的糞便顆粒數在暈動刺激第1天到第8天有顯著差異(P<0.05)，在第9天到第14天無差別(P>0.05)；實時高嶺土攝入量在暈動刺激第3天到第27天有顯著差異(P<0.05)，在第29天到第33天無差別(P>0.05)；24h高嶺土攝入量在暈動刺激第3天到第29天有顯著差異(P<0.05)，在第31天到第33天無差別(P>0.05)。與靜止對照組相比，自發(fā)活動量和

21、活動次數均在暈動刺激第1、4天降低(P<0.05)，第7天恢復到對照組水平(P>0.05)。
　　 5、脫適應規(guī)律觀察實驗
　　 糞便顆粒數在脫適應5d仍維持在靜止對照組水平(P>0.05)，在脫適應7d達到旋轉對照組水平。自發(fā)活動量和活動次數隨著脫適應天數的增加而增加，在第21天顯示與旋轉對照組無明顯差異(P>0.05)，這說明其已經達到脫適應水平。其它指標也顯示部分脫適應組與對照組有差別，但都沒有規(guī)律性。
　　

22、 二、前庭核NMDA受體信號通路在暈動癥適應-脫適應過程中的作用
　　 1、暈動癥適應過程中尾側前庭核NR1、NR2A/B、GABAAα1蛋白水平和αCaMKⅡ、CREB蛋白磷酸化水平的變化
　　 統(tǒng)計分析顯示旋轉刺激組動物的GABAAα1蛋白水平、αCaMKⅡ蛋白磷酸化水平在暈動刺激第1、4天增加(P<0.05)，第7天恢復到靜止對照組水平(P>0.05)；CREB蛋白磷酸化水平在暈動刺激第1、4、7、10天增加(P

23、<0.05)，第13天恢復到靜止對照組水平(P>0.05)；NRl和NR2A/B蛋白水平無顯著變化(P>0.05)。
　　 2、暈動癥適應過程中尾側前庭核Fos、Arc和BDNFmRNA表達水平的變化
　　 統(tǒng)計分析顯示旋轉刺激組動物的FosmRNA表達水平在暈動刺激第1、4天增加(P<0.05)，ArcmRNA表達水平在暈動癥第1、4天減少(P<0.05)，均在第7天恢復到靜止對照水平(P>0.05)；BDNFmRNA

24、表達水平無顯著變化(P>0.05)。
　　 3、暈動癥適應過程中Fos在尾側前庭核神經元中表達的變化
　　 方差分析顯示SpVe和MVe中的Fos標記神經元在旋轉刺激組和對照組之間均有顯著差別(P<0.01)。Dunnett-ttest顯示在暈動刺激第1、4、7天，Fos標記神經元增加(P<0.05)，在刺激第10天起恢復到對照水平(P>0.05)。
　　 4、暈動癥適應過程中GABAAlα1和Arc在尾側前庭核

25、神經元中共表達
　　 方差分析顯示Arc標記神經元、GABAAα1標記神經元和GABAAα1/Arc共標記神經元在旋轉刺激組和對照組之間有顯著差別(p<0.01)。Dunnett-ttest顯示在暈動刺激第1、4天，GABAAα1標記神經元增加(P<0.05)，Arc標記神經元和GABAaα1/Arc共標記神經元減少(P<0.05)，在刺激第7天起恢復到對照水平(P>0.05)。
　　 三、海馬NMDA受體信號通路在暈動

26、癥適應-脫適應過程中的作用
　　 1、暈動癥適應過程中海馬NR1、NR2A/B蛋白水平和αCaMKⅡ、CREB蛋白磷酸化水平的變化
　　 統(tǒng)計分析顯示，旋轉刺激組動物αCaMKⅡ蛋白磷酸化水平在暈動刺激第1、4、7、10天無顯著變化(P>0.05)，第13天升高(P<0.05)；CREB蛋白磷酸化水平在暈動刺激第1、4、7、10天緩慢增加(P>0.05)，第13天與靜止對照組相比顯著升高(P<0.05)；NR1和NR2A

27、/B蛋白水平無顯著變化(P>0.05)。
　　 2、暈動癥適應過程中海馬Fos、Arc和BDNFmRNA表達水平的變化
　　 統(tǒng)計分析顯示，Fos、Arc、BDNFmRNA表達水平在旋轉刺激組和靜止對照組之間無明顯差別(P>0.05)。
　　 3、暈動癥脫適應過程中海馬αCaMKⅡ、CREB蛋白磷酸化水平變化
　　 統(tǒng)計分析顯示，αCaMKⅡ蛋白磷酸化水平在脫適應第1天無明顯變化(P>0.05)，在第4、

28、7、14天升高(P<0.05)，第21天恢復到對照水平(P>0.05)。
　　 統(tǒng)計分析顯示，CREB蛋白磷酸化水平在暈動刺激第1、4天升高(P<0.05)，第7、14、21天恢復到對照水平(P00.05)。
　　 4、KN-93對暈動癥脫適應行為學的影響
　　 統(tǒng)計分析顯示，糞便顆粒數、自發(fā)活動量、活動次數在各時間點的生理鹽水組和脫適應組之間均無差別(P>0.05)。抑制劑組動物的糞便顆粒數在脫適應6、8、10

29、d增加(P<0.05)，自發(fā)活動量在脫適應6、10d降低(P<0.05)，活動次數在脫適應6、8、10d降低(P<0.05)。
　　 結論:
　　 1、與異嗜高嶺土行為比較，排便量和自發(fā)活動是大鼠暈動癥判斷較為敏感和可靠的指標，其中糞便顆粒計數操作簡單，不易出現測量誤差；暈動刺激后的自發(fā)活動也是暈動癥敏感的行為學指標，綜合運用這些指標有利于提高大鼠暈動癥嚴重程度判斷的準確性，是較為可靠的暈動癥行為學實驗方法；24h高嶺土

30、攝入量作為使用廣泛的指標，也能反映大鼠暈動癥癥狀，但其表現具有一定的延遲性。
　　 2、糞便顆粒數的適應時間為9d，脫適應時間為7d；自發(fā)活動量和活動次數的適應時間為7d，脫適應時間為21d。指標不一致的原因可能是由于中樞神經系統(tǒng)和自主神經系統(tǒng)反映的不一致性引起的，因此，暈動癥完全適應時間為9d，完全脫適應時間為21d。
　　 3、在暈動癥癥狀期(1、4d)，大鼠尾側前庭核中CaMKⅡα、CREB活性和FosmRNA、蛋

31、白表達水平升高，GABAAα1受體蛋白水平升高，ArcmRNA表達水平下降；在適應期(13d)，CaMKⅡα活性，Fos、ArcmRNA表達水平和Fos、GABAAα1受體蛋白水平均恢復到對照組水平。并且這些分子的改變與暈動癥適應過程中行為學改變有明顯相關性，說明大鼠尾側前庭核中NMDA受體信號通路活性和GABAAα1受體水平的升高與暈動癥適應的形成是相關的，可能為暈動癥的適應提供了分子基礎。
　　 4、在暈動癥適應期，大鼠海馬