NMDA受體及其亞單位在大鼠NSCs增殖、分化以及腦缺血中作用的研究.pdf

1、第一部分：NMDA對(duì)大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響 目的:觀測(cè)體外培養(yǎng)胎鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞NMDA受體亞單位的表達(dá)情況，并探討NMDA對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖以及分化為神經(jīng)細(xì)胞的作用。 方法: 1、從孕18～19d大鼠海馬分離神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)，無血清培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)、單細(xì)胞克隆，誘導(dǎo)分化后行Nestin、β-ⅢTubulin和GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)鑒定細(xì)胞性質(zhì)和類型。 2、取原代、1代、2代培養(yǎng)處于指數(shù)生

2、長期的NsCs進(jìn)行①NR1、NR2A、NR2B免疫熒光細(xì)胞染色；②Western Blot檢測(cè)NR1、NR2A、NR2B蛋白質(zhì)的表達(dá)；⑨RT-PCR測(cè)NR1、NR2A、NR2BmRNA的表達(dá)。 3、將傳代培養(yǎng)1次NSCs與不同濃度NMDA共同培養(yǎng)3d、7d、12d，MTT法測(cè)細(xì)胞增殖情況。 4、將傳代培養(yǎng)1次NSCs與不同濃度NMDA共同培養(yǎng)3d，用含10％FBS的DMEM/F12誘導(dǎo)貼壁分化，分別于7d、12d行β-Ⅲ

3、Tubulin免疫細(xì)胞化學(xué)染色。光鏡下用網(wǎng)格目鏡尺計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，以計(jì)算神經(jīng)元的分化比例。 結(jié)果: 1、從胎鼠海馬分離培養(yǎng)的細(xì)胞具有自我更新能力和多分化潛能。表達(dá)神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白(Nestin)，分化后呈β-ⅢTubulin、GFAP免疫反應(yīng)陽性。 2、1代、2代NSCs NMDA受體亞單位NR1、NR2A、NR2B均呈免疫熒光反應(yīng)陽性。Western blot結(jié)果顯示，在115KD、177KD和178KD處出現(xiàn)

4、陽性條帶?；叶燃敖y(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯示三種亞單位的光密度值在原代、1代和2代均無明顯差異。原代、1代和2代細(xì)胞，RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳在402bp、280bp和220bp處出現(xiàn)強(qiáng)熒光條帶。 3、MTT結(jié)果顯示，NMDA作用3d、7d和12d時(shí)，100μM NMDA組與正常組OD值相比明顯增加(P<0.05)，其它各組與正常組OD值相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各實(shí)驗(yàn)組OD值相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 4、誘導(dǎo)分

5、化7d，12d時(shí)，正常組陽性細(xì)胞率分別為47.6％，41.5％。在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的比例與相應(yīng)正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且各組間比較差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論: 1、從胎鼠海馬分離培養(yǎng)的細(xì)胞具備神經(jīng)干細(xì)胞的基本屬性，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細(xì)胞。 2、早期培養(yǎng)的海馬NSCs中NR1、NR2A、NR2B蛋白質(zhì)和mRNA穩(wěn)定表達(dá)。 3、NMDA濃度為100gM持續(xù)作用時(shí)，對(duì)胎鼠

6、海馬NSCs增殖有促進(jìn)作用。 4、一定條件下，NMDA在濃度為100μM及其以下時(shí)，不影響神經(jīng)干細(xì)胞的分化趨勢(shì)。 第二部分：NMDA受體亞單位2B在海馬缺血再灌注損傷中的作用 目的:探討NMDA受體亞單位2B選擇性拮抗劑Ro25-6981對(duì)成年大鼠短暫性前腦缺血再灌注海馬CA1區(qū)損傷神經(jīng)元保護(hù)作用和神經(jīng)發(fā)生的影響。 方法:健康成年雄性SD大鼠(250±25 g)隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組(又分藥物組、生理鹽

7、水對(duì)照組)和缺血再灌注組(又分藥物組、生理鹽水對(duì)照組)。采用四動(dòng)脈阻斷(4AO)大鼠前腦缺血15 min再灌注模型。假手術(shù)組和手術(shù)組大鼠均于術(shù)前30 min腹腔注射不同劑量Ro25-6981(0.3mg/kg、0.6 mg/kg、1.2 mg/kg)、生理鹽水(NS)。采用焦油紫、TUNEL染色以及免疫組織化學(xué)技術(shù)顯示再灌注第1d、3d、7d天各組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的構(gòu)筑及病理改變、細(xì)胞凋亡以及BrdU陽性細(xì)胞。計(jì)數(shù)各組大鼠海馬C

8、A1區(qū)TUNEL、BrdU陽性細(xì)胞。 結(jié)果: 1、焦油紫結(jié)果顯示正常大鼠海馬錐體細(xì)胞境界清楚，排列整齊，胞漿被染成淡紫色，胞核不著色，核仁著色。假手術(shù)組細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變。短暫性前腦缺血后1d，海馬CA1區(qū)也未見細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)的明顯改變。缺血后3d，CA1區(qū)出現(xiàn)壞死細(xì)胞，特征為體積明顯縮小，細(xì)胞間隙擴(kuò)大，細(xì)胞固縮呈深紫色。缺血后7d，CA1區(qū)壞死細(xì)胞體積進(jìn)一步縮小，呈“米?！睜钌⒃诜植荚谡＜?xì)胞之間。 2、短暫

9、性前腦缺血再灌后1d，海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層出現(xiàn)TUNEL，陽性細(xì)胞，為11.33±1.17個(gè)/mm<'2>，再灌后3d時(shí)陽性細(xì)胞增多，達(dá)到43.33±1.47個(gè)/mm<'2>，再灌后7d時(shí)有所減少。再灌后3d，手術(shù)組中注射0.6 mg/kg Ro25-6981組的凋亡細(xì)胞數(shù)與相應(yīng)對(duì)照組凋亡數(shù)相比明顯減少(P<0.01)。 3、BrdU陽性細(xì)胞胞核為圓形，核染為棕黃色。缺血刺激海馬CA1區(qū)細(xì)胞增殖，1d開始，3d增殖達(dá)高峰，Br