FGFR3在骨重塑調節(jié)過程中的作用及機制研究.pdf

1、成纖維生長因子受體家族（FGFRs）共有四個成員：FGFR1、FGFR2、FGFR3及FGFR4。四個受體分別通過與FGF結合發(fā)生級聯(lián)反應，激活胞內信號從而發(fā)揮其生理功能。其中FGFR3主要負性調節(jié)軟骨發(fā)育。FGFR3功能增強點突變可引起軟骨發(fā)育障礙導致一系列人類骨骼遺傳?。很浌前l(fā)育不全(ACH),季肋發(fā)育不良(HCH)以及致死性軟骨發(fā)育不全(TD)。通過建立模擬人類相關遺傳病的FGFR3點突變小鼠（ACH小鼠）模型，發(fā)現FGFR3增強

2、導致骨形成過程障礙、骨量降低，同時肥大軟骨細胞分化受到抑制。FGFR3敲除小鼠雖生長板增寬、肥大軟骨細胞分化增強，但該小鼠與增強小鼠同樣表現為骨量降低、皮質骨變薄。上述兩種小鼠是在所有細胞中敲除或增強FGFR3，無法區(qū)分FGFR3在特定細胞中的作用。
　　在骨骼發(fā)育過程中，軟骨細胞、成骨細胞及破骨細胞間的串話是影響軟骨內成骨過程的重要環(huán)節(jié)。在 ACH小鼠模型中，軟骨細胞肥大分化過程受到抑制，由成骨細胞主導的骨形成減慢。前期研究表明

3、，在軟骨內特異性敲除FGFR3引起B(yǎng)MP2/4/7表達增高，同時BMPs拮抗抑制分子Noggin表達降低；同時IHH表達增高明顯。這些結果證實了軟骨細胞中的FGFR3水平降低可引起促成骨細胞相關分子表達增加。但敲除FGFR3軟骨細胞中的這些信號分子是否能影響成骨細胞有待進一步證實。另一方面軟骨細胞能夠通過與破骨細胞串話進而引起骨重塑過程的改變。但軟骨細胞中缺失FGFR3后是否可以直接調節(jié)破骨吸收過程，還是先通過改變成骨細胞功能而后影響破

4、骨吸收過程尚不清楚。因此我們擬通過成骨-軟骨細胞共培養(yǎng)模型來明確敲除 FGFR3的軟骨細胞是如何調控軟骨內成骨過程。
　　FGFR3除通過調節(jié)軟骨細胞功能間接影響骨形成外，也可直接影響小鼠成骨過程。參與骨形成過程中的成骨細胞主要來源于間充質細胞，歷經成骨前體細胞，分化成為成熟成骨細胞。成熟成骨細胞能分泌類骨質與胞外基質。隨著鈣的沉積類骨質礦化，將成熟成骨細胞包埋其中。模擬人軟骨發(fā)育不全的FGFR3增強型點突變小鼠模型表現為成骨細胞

5、增殖減慢，礦化障礙，但ALP活性增高，并且進一步證實FGFR3通過P38通路抑制間充質細胞增殖，又通過ERK1/2調節(jié)礦化過程。使用Col1啟動子介導的早期成骨細胞 FGFR3功能增強小鼠表現為骨量明顯減少，早期成骨細胞標志基因 Col1表達增高，但OP表達無變化。這些結果均提示FGFR3能直接調控早期成骨細胞功能。但成熟成骨細胞中 FGFR3功能發(fā)生改變是否會引起骨重塑過程發(fā)生變化需要進一步研究。
　　終末成熟成骨細胞除凋亡、轉

6、變?yōu)楣且r細胞兩種命運轉歸外，還能轉變?yōu)樯嬗诠琴|中的骨細胞。骨細胞是人體骨組織中數量最多、壽命最長、分布最廣的成骨系細胞。骨細胞近年來也被證實能夠通過旁分泌途徑調節(jié)骨重塑過程。骨細胞可以通過樹突與骨質表面附著的成骨細胞及破骨細胞產生串話，傳遞信號。壓力或化學信號刺激能引起骨細胞SOST水平變化，從而影響成骨細胞分化及功能。另外骨細胞還可通過分泌RANKL調節(jié)破骨吸收功能。體外和體內實驗證據均表明FGFR3在骨細胞中表達，因此我們推測FG

7、FR3可能參與骨細胞功能維持，并參與骨重塑過程。
　　研究方法:
　　第一部分FGFR3在骨細胞中的作用及機制研究
　　1.建立骨細胞敲除FGFR3小鼠模型：通過將Fgfr3flox/flox小鼠與Dmp1-Cre小鼠交配，獲得子代為 Dmp1-Cre；Fgfr3flox/flox小鼠。該小鼠中 FGFR3在骨細胞中被特異性敲除。Dmp1-Cre；Fgfr3flox/flox小鼠與同窩Fgfr3flox/flox小鼠于

8、3月齡及6月齡取材，獲得股骨、脛骨用于實驗；
　　2.利用免疫組化檢測FGFR3與OC蛋白水平變化，同時取3月齡小鼠股骨及脛骨提取骨組織RNA定量分析FGFR3的表達；
　　3.通過數字X光成像掃描小鼠股骨、尾椎骨等觀察小梁骨及皮質骨影像學變化，通過Micro-CT三維重建股骨掃描數據，分別量化評估小鼠小梁骨及皮質骨；
　　4.使用染色骨組織石蠟切片從組織學評估骨量、成骨細胞數量、成骨細胞表面積等指標，使用硬組織切片進

9、行熒光雙色雙標評價骨形成速率，Von Kossa染色用來觀察小梁骨表面是否存在礦化差異。
　　5.通過TRAP染色觀察破骨細胞數量及破骨吸收表面積，同時使用骨組織RNA定量檢測其中RankL和Opg表達變化；
　　6. TUNEL法用以檢測骨組織中骨細胞凋亡情況。
　　第二部分成熟成骨細胞中FGFR3的功能研究
　　1.建立成熟成骨細胞內特異性敲除FGFR3小鼠模型并觀察其整體表型；
　　2.利用 X線觀察

10、成熟成骨細胞內特異性敲除 FGFR3小鼠骨骼表型，Micro-CT掃描重建則用于評估敲除小鼠骨骼相關指標，明確其骨量變化；
　　3.熒光雙標檢測敲除小鼠骨形成速率，Von Kossa染色用于觀察小鼠骨量及未礦化類骨質有無異常沉積，OC免疫組化用于觀察成骨細胞功能；
　　4.使用TRAP染色觀察成熟成骨細胞內特異性敲除FGFR3后小鼠破骨細胞形成情況；
　　第三部分FGFR3通過旁分泌作用調節(jié)骨形成
　　1.成骨-

11、軟骨細胞共培養(yǎng)細胞體系的建立：分離了出生后1-3天的Fgfr3flox/flox小鼠(WT)和 Col2-Cre；Fgfr3flox/flox(MUT)小鼠原代軟骨細胞和 WT小鼠顱骨原代成骨細胞。通過Trans-well共培養(yǎng)系統(tǒng)，上層分別接種WT和MUT小鼠原代軟骨細胞，下層接種WT顱骨原代成骨細胞進行實驗；
　　2.通過茜素紅及 ALP染色觀察成骨-軟骨細胞共培養(yǎng)下層成骨細胞礦化情況及ALP陽性細胞數量，并且通過ALP定量檢

12、測ALP活性是否發(fā)生變化；
　　3.提取共培養(yǎng)14天的原代成骨細胞RNA，反轉后通過定量PCR檢測成骨相關基因Cbfa1、Col1、OC的表達觀察成骨細胞功能變化；
　　4.提取原代軟骨細胞RNA并定量檢測軟骨細胞中RankL和Opg表達變化，同時使用上述共培養(yǎng)體系下層原代成骨細胞RNA定量檢測成骨細胞中RankL和Opg水平變化，明確引起MUT小鼠破骨吸收功能降低的原因；
　　5.提取成骨-軟骨細胞共培養(yǎng)上層原代軟骨

13、細胞RNA，定量檢測TGF-β1、TGF-βi、Wnt2、Wnt3、Wnt4、Wnt5b表達，探尋軟骨細胞中FGFR3影響骨形成的潛在細胞串話機制。
　　實驗結果：
　　一、 FGFR3在骨細胞中的作用及機制研究
　　1.使用Dmp1啟動子驅動的Cre工具小鼠可在骨細胞中有效敲除FGFR3；
　　2.骨細胞 FGFR3失活（Dmp1-Cre；Fgfr3flox/flox）引起小鼠骨量降低，骨小梁厚度及數量減少，骨

14、小梁間隙增寬，同時皮質骨厚度變薄，皮質骨骨體積減少；
　　3.骨細胞內FGFR3失活后，骨小梁雙色雙標間距變窄，骨形成速率減慢；
　　4. Dmp1-Cre；Fgfr3flox/flox小鼠與同窩Fgfr3flox/flox小鼠相比，骨小梁表面成骨細胞數量減少明顯，成骨細胞鋪展表面積降低，髓腔內側皮質骨表面成骨細胞形態(tài)變?yōu)楸馄?，提示其生成骨能力減弱；
　　5. Dmp1-Cre；Fgfr3flox/flox小鼠小梁骨及

15、髓內側皮質骨破骨細胞增多、破骨吸收表面積增加顯著，同時骨組織RNA結果提示RankL/Opg增高，提示Dmp1-Cre；Fgfr3flox/flox小鼠破骨吸收能力增強；骨細胞凋亡無明顯改變。
　　二、成熟成骨細胞中FGFR3的功能研究
　　1.成熟成骨細胞內特異性FGFR3功能失活小鼠體型變短，體重減輕，同時骨量降低顯著；
　　2.成熟成骨細胞內特異性敲除FGFR3小鼠骨形成障礙，成骨細胞數量降低，同時OC表達降低，

16、成骨細胞分化能力減弱；
　　3.成熟成骨細胞內特異性FGFR3功能失活小鼠破骨吸收能力無變化；
　　三、FGFR3通過細胞間串話調節(jié)軟骨內成骨過程
　　1.通過成骨-軟骨細胞共培養(yǎng)后，成骨細胞礦化能力增強，ALP活性增高，同時成骨相關標志基因Col1、OC、Cbfa1表達增高；
　　2.除軟骨細胞Ihh、Bmp2/4/7增高，Noggin降低以外，Wnt-4、TGF-β1表達增高；
　　3.成骨-軟骨細胞共