FGFR3在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生和發(fā)展中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是一種在老年人中常見的退行性關(guān)節(jié)病變,是導(dǎo)致老年人行走不便的最主要疾病。骨性關(guān)節(jié)炎為關(guān)節(jié)慢性進(jìn)行性病變,多累及負(fù)重關(guān)節(jié),臨床上以關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)活動(dòng)受限、關(guān)節(jié)畸形為特點(diǎn)。目前國內(nèi)外對(duì)OA的研究雖然較多,但是仍然缺乏有效安全防治骨性關(guān)節(jié)炎的藥物。研究早期影響骨性關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的分子機(jī)制,有利于尋找延緩關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的藥物,研發(fā)早期治療措施。
　　FGFR3(Fibroblast growth f

2、actor receptor3,FGFR3)屬于成纖維細(xì)胞生長因子受體家族,為酪氨酸激酶受體,其配體為成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblast growth factors, FGFs)。在23種FGFs中,FGF9和FGF18是FGFR3的相對(duì)特異性配體。FGFR3除了在骨骼發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用外,其在關(guān)節(jié)軟骨的發(fā)育以及關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮重要作用。FGFR3敲除小鼠會(huì)出現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎的表型,其關(guān)節(jié)軟骨中MMP13的表達(dá)升高,提

3、示FGFR3對(duì)關(guān)節(jié)軟骨起保護(hù)作用,但是FGFR3敲除小鼠出現(xiàn)OA表型并沒有排除其骨骼畸形的力學(xué)影響。FGF9是FGFR3的相對(duì)特異性配體,在小鼠中FGF9突變會(huì)導(dǎo)致肘關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)的骨性聯(lián)結(jié)綜合征(Elbow knee synostosis, EKS),在人可引起多發(fā)性骨性連接綜合征(Multiple synostosis syndrome, SYNS),EKS和SYNS的重要特點(diǎn)就是小鼠或者患者出現(xiàn)關(guān)節(jié)融合等癥狀。這些結(jié)果提示FGFR3

4、在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中起重要作用,但FGFR3調(diào)節(jié)軟骨修復(fù)的具體機(jī)制尚不明確。
　　為了進(jìn)一步探討FGFR3在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制,我們使用FGFR3軟骨特異性誘導(dǎo)敲除和持續(xù)激活小鼠,來探索FGFR3在關(guān)節(jié)炎發(fā)生和發(fā)展過程中對(duì)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)過程的影響。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1、建立三種小鼠模型,其中Fgfr3G369C/+小鼠為FGFR3增強(qiáng)型點(diǎn)突變小鼠(模擬人的ACH疾病,稱為ACH小鼠),Col2a1-Cr

5、eERT2;Fgfr3flox/flox小鼠為FGFR3軟骨特異性誘導(dǎo)敲除小鼠(Fgfr3 conditional induced knock out,簡稱為Fgfr3 cKO小鼠), Col2a1-CreERT2;Fgfr3+/K644Eneo小鼠為 FGFR3軟骨異性誘導(dǎo)持續(xù)激活小鼠( Fgfr3 conditonal induced activation,簡稱為Fgfr3 cActivation小鼠)。PCR鑒定小鼠基因型。在Fg

6、fr3 cKO小鼠和Fgfr3 cActivation小鼠2月齡時(shí)腹腔注射Tamoxifen,連續(xù)注射5天,使小鼠在成年期軟骨中敲除或激活FGFR3;
　　2、建立小鼠關(guān)節(jié)炎模型,即老年自發(fā) OA模型和 DMM(Destablilization of the medial meniscus)手術(shù)誘導(dǎo)的OA模型。DMM手術(shù)即顯微手術(shù)挑斷內(nèi)側(cè)半月板脛骨韌帶,造成小鼠內(nèi)側(cè)半月板不穩(wěn)定而關(guān)節(jié)軟骨磨損形成OA。在Fgfr3 cKO小鼠和Fg

7、fr3 cActivation小鼠注射完Tamoxifen后行DMM手術(shù)。
　　3、ACH小鼠在12月和20月齡時(shí)取材,Fgfr3 cKO和Fgfr3 cActivation小鼠分別在3月齡和4月齡時(shí)取材。使用X光觀察Fgfr3 cKO小鼠4月齡時(shí)體長和關(guān)節(jié)大體情況。制備以上小鼠標(biāo)本的組織切片。使用藏紅固綠染色觀察關(guān)節(jié)軟骨情況,并參考OARSI(Osteoarthrisits Research Society Internatio

8、nal)推薦方法對(duì)ACH小鼠、Fgfr3 cKO和Fgfr3 cActivation小鼠的關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)丟失和損傷情況進(jìn)行評(píng)分。使用免疫組化染色觀察關(guān)節(jié)軟骨Col II、Collagen X以及MMP13的表達(dá),在Fgfr3 cKO小鼠關(guān)節(jié)軟骨中觀察FGFR1的表達(dá)。
　　4、體外培養(yǎng)Fgfr3 cKO小鼠原代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,用4-hydroxyTamoxifen處理,在原代軟骨細(xì)胞中敲除Fgfr3,然后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Mm

9、p13、Collagen X、Collagen II、Adamts-5、Ihh的表達(dá)。
　　5、通過轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)使 ATDC5細(xì)胞過表達(dá) Fgfr3,利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測Mmp13、Collagen X的表達(dá)。
　　主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1、Fgfr3 cKO小鼠關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生異常肥大化并在DMM手術(shù)后關(guān)節(jié)損傷加重。
　　(1) Fgfr3 cKO小鼠骨骼大體發(fā)育正常;
　　(2) Fgfr3 cKO小鼠關(guān)

10、節(jié)軟骨肥大化并在DMM手術(shù)后1月后關(guān)節(jié)軟骨損傷加重;
　　(3) Fgfr3 cKO小鼠關(guān)節(jié)軟骨MMP13、Collagen X表達(dá)升高而Collagen II表達(dá)降低;
　　(4) Fgfr3 cKO小鼠關(guān)節(jié)軟骨FGFR3表達(dá)降低而FGFR1表達(dá)增高;
　　(5) Fgfr3cKO小鼠原代軟骨細(xì)胞Mmp13、Collagen X、Adatms-5和Ihh表達(dá)上調(diào)
　　2、老年自發(fā)骨關(guān)節(jié)炎模型中 ACH小鼠關(guān)節(jié)軟

11、骨細(xì)胞外基質(zhì)降解延遲,并且其MMP13、Collagen X表達(dá)降低。
　　3、Fgfr3cActivation小鼠關(guān)節(jié)軟骨在 DMM手術(shù)后關(guān)節(jié)軟骨損傷過程延遲發(fā)生。DMM術(shù)后Fgfr3 cActivation小鼠關(guān)節(jié)軟骨MMP13和Collagen X表達(dá)降低而Collagen II表達(dá)升高。
　　4、ATDC5細(xì)胞中過表達(dá)Fgfr3導(dǎo)致Mmp13、Collagen X表達(dá)下調(diào)。
　　主要結(jié)論:
　　通過上述分