常山酮對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本研究旨在通過(guò)研究常山酮對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β通路、Th17細(xì)胞分化以及血管形成方面的作用來(lái)探討闡述骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制，為骨性關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和臨床治療提供一個(gè)新的視點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　（一）常山酮對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨下骨及關(guān)節(jié)軟骨的影響
　　1.動(dòng)物模型的建立
　　從Charles River購(gòu)買了3個(gè)月大小的雄性的C57BL/6J(WT)小鼠和Lewis大鼠。鼠被分為三組:對(duì)照組、實(shí)

2、驗(yàn)組給予常山酮及實(shí)驗(yàn)組給予安慰劑PBS。小鼠藥物注射為腹腔內(nèi)注射，劑量為1mg/kg，隔天一次，注射一個(gè)月。大鼠予以局部包埋藥物。鼠在麻醉的狀態(tài)下予以做前交叉韌帶切斷術(shù)(ACLT)以建立骨性關(guān)節(jié)炎模型。
　　2.關(guān)節(jié)軟骨各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)
　　通過(guò)H&E和Safranin O and fast green染色來(lái)判斷關(guān)節(jié)軟骨大體的情況。關(guān)節(jié)從軟骨至骨基本結(jié)構(gòu)是:透明軟骨、鈣化軟骨、軟骨下骨生長(zhǎng)版、軟骨下骨、生長(zhǎng)板及骨質(zhì)結(jié)構(gòu)。透明軟

3、骨與鈣化軟骨之間有一條tidemark線。以此tidemark線的上移與否可以判斷關(guān)節(jié)軟骨鈣化的情況。Safranin O染色可以把關(guān)節(jié)軟骨染為紅色，骨為綠色。在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中，關(guān)節(jié)軟骨退行性病變，會(huì)致使關(guān)節(jié)軟骨糖蛋白丟失，使軟骨著色變淺或者引起軟骨下骨的浸潤(rùn)，有綠色骨組織出現(xiàn)。
　　繼而我們通過(guò)免疫染色去檢測(cè)軟骨分子蛋白的變化來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證軟骨的變化情況。我們選用的指標(biāo)是Lubricin，（基質(zhì)金屬蛋白酶）MMP13及（膠

4、原酶）Col X.Lubricin分布關(guān)節(jié)軟骨的表明。大量實(shí)驗(yàn)證明，很多關(guān)節(jié)組織都分泌Lubricin，包括關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、半月板細(xì)胞以及交叉韌帶細(xì)胞等。
　　最后我們用Osteoarthritis Research Society International(OARSI)-modifiedMankin scores來(lái)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的破壞程度給以量化評(píng)價(jià)。在評(píng)價(jià)量表中，總分等于等級(jí)乘以階段(score=grade x stag

5、e)。
　　3.軟骨下骨各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)
　　使用三維micro-CT掃描骨組織結(jié)構(gòu)來(lái)測(cè)骨微觀結(jié)構(gòu)的變化情況。
　　對(duì)軟骨下骨的骨重塑進(jìn)行檢測(cè)。我們用免疫染色的方法染色軟骨下骨TRAP及Osterix的變化情況。
　?。ǘ┏Ｉ酵獙?duì)骨性關(guān)節(jié)炎早期軟骨下骨Th17細(xì)胞的影響
　　1.檢測(cè)Th17細(xì)胞在軟骨下骨的變化情況
　　通過(guò)免疫染色來(lái)確定軟骨下骨Th17細(xì)胞的變化。Th17屬于CD4+的免疫T細(xì)胞，其

6、分泌IL17來(lái)發(fā)揮作用。
　　2.檢測(cè)軟骨下骨RANKL量的變化
　　我們采用免疫熒光染色的方法去定量軟骨下骨RANKL含量。RANKL是破骨細(xì)胞分化的必須物質(zhì)。在軟骨下骨的微環(huán)境中，Th17將分泌IL17因子作用于軟骨下骨的成骨細(xì)胞上，成骨細(xì)胞將分泌RANKL作用于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞而促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成而促進(jìn)骨吸收。
　?。ㄈ┏Ｉ酵獙?duì)軟骨下骨MSCs細(xì)胞TGF-β介導(dǎo)的smad2/3信號(hào)通路的影響
　　1.體外

7、培養(yǎng)MSCs，Western Blot觀察常山酮對(duì)TGF-β通路的影響
　　我們從Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute獲得GFP標(biāo)記的成年鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs。
　　2.動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)免疫染色MSCs和磷酸化的smad2/3
　　應(yīng)用免疫組化及免疫熒光的方法在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證常山酮對(duì)軟骨下骨轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β信號(hào)通路的影響。

8、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β信號(hào)通路的機(jī)制是細(xì)胞外的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β配體與細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β受體Ⅱ結(jié)合，后轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β受體Ⅱ?qū)?dòng)員招募轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β受體Ⅰ，從而形成轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β受體復(fù)合物。
　　（四）常山酮對(duì)軟骨下骨異常血管形成的影響
　　1.血管造影
　　采用基于三維CT的血管造影來(lái)檢測(cè)在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程軟骨下骨血管的變化情況。方法是當(dāng)給予鼠安樂(lè)死后，打開(kāi)胸腔找到有心室用針

9、尖扎個(gè)孔，或用剪刀剪破。后從左心室進(jìn)針沖洗整個(gè)體循環(huán)。
　　2.免疫熒光染色CD31及Endomucin驗(yàn)證軟骨下骨血管情況
　　通過(guò)使用免疫熒光染色進(jìn)一步驗(yàn)證軟骨下骨血管形成情況。我們使用免疫熒光雙染CD31及Enmucin來(lái)確定H型血管(CD31+Endomucin+)的變化。H型血管(CD31+Endomucin+)是一種特殊類型的血管，他只出現(xiàn)在骨系統(tǒng)中，在其他系統(tǒng)或組織中陰性。同時(shí)在骨系統(tǒng)中，H型CD31+Endo

10、mucin+血管只出現(xiàn)在骨形成時(shí)期，即此血管主要作用是偶聯(lián)血管形成和骨的形成。
　　結(jié)果：
　　1.常山酮對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨下骨及關(guān)節(jié)軟骨的影響
　　我們發(fā)現(xiàn)常山酮緩解了關(guān)節(jié)軟骨的破壞。H&E染色顯示在非常山酮治療組中關(guān)節(jié)軟骨的tidemark線上移，而常山酮治療抑制了這一現(xiàn)象。
　　臨床結(jié)果已表明，在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中，軟骨下骨過(guò)度的骨吸收釋放激活的過(guò)多的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β。過(guò)多的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β打

11、破了原來(lái)軟骨下骨中正常的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β濃度梯度，從而將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs動(dòng)員誘導(dǎo)至骨髓腔形成異位骨島，而非將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)至骨吸收部位以偶聯(lián)骨吸收，最終誘導(dǎo)關(guān)節(jié)力學(xué)環(huán)境的環(huán)境的改變，誘導(dǎo)了關(guān)節(jié)軟骨的破壞并最終發(fā)展成骨性關(guān)節(jié)炎。
　　2.常山酮對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎早期軟骨下骨Th17細(xì)胞的影響
　　Th17細(xì)胞可以通過(guò)分泌IL17來(lái)調(diào)控RANKL的分泌，來(lái)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的成熟和分化。在本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ颓闆r下，骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病

12、早期，由于前交叉韌帶被切斷導(dǎo)致關(guān)節(jié)不穩(wěn)，關(guān)節(jié)不穩(wěn)則引起關(guān)節(jié)應(yīng)力發(fā)生改變而導(dǎo)致異常應(yīng)力刺激。而引起關(guān)節(jié)的局部炎癥反應(yīng)，如炎癥細(xì)胞的滲出，包括CD4陽(yáng)性的T細(xì)胞。同時(shí)由于軟骨下骨在骨重塑的情況下，會(huì)釋放活化的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β以偶聯(lián)骨形成和骨吸收。
　　應(yīng)用免疫熒光的方法定量RANKL在軟骨下骨的表達(dá)。如前所述，Th17細(xì)胞是通過(guò)分泌IL17因子作用于骨髓基質(zhì)細(xì)胞或成骨前體細(xì)胞，以促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞或成骨前體細(xì)胞來(lái)分泌RANKL來(lái)最

13、終促進(jìn)破骨細(xì)胞的成熟及骨吸收。因此我們免疫熒光染色RANKL去驗(yàn)證是否軟骨下骨Th17伴隨著RANKL含量的增加。
　　3.常山酮對(duì)軟骨下骨MSCs細(xì)胞TGF-β介導(dǎo)的smad2/3信號(hào)通路的影響
　　骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，是基于關(guān)節(jié)受到異常的力學(xué)刺激，引起關(guān)節(jié)軟骨釋放激活過(guò)多的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β，過(guò)多轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β破壞了原來(lái)關(guān)節(jié)內(nèi)的溶度梯度，從而將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs誘導(dǎo)至骨髓腔形成異位骨島從而誘導(dǎo)骨性關(guān)節(jié)炎的

14、發(fā)生。正常受力情況下，關(guān)節(jié)軟骨下骨進(jìn)行著正常的骨重塑，即破骨細(xì)胞吸收骨質(zhì)，同時(shí)激活釋放儲(chǔ)存在骨基質(zhì)中的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，激活smad2/3通路TGF-β通路，從而將作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)誘導(dǎo)至骨吸收表面，以偶聯(lián)骨吸收和骨形成。
　　4.常山酮對(duì)軟骨下骨異常血管形成的影響
　　軟骨下骨的異常血管形成對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生至關(guān)重要。骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中，軟

15、骨下骨血管的數(shù)量和體積均增加。異位骨島的形成在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中的作用至關(guān)重要。血管為骨島的形成提供所必須的MSCs，同時(shí)也為骨組織提供必需的氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。
　　骨的形成總是伴隨著血管的生成。H型血管，是最近剛被篩選出來(lái)的一種只出現(xiàn)在骨組織的血管，且只在骨形成的過(guò)程中，即這種H型血管偶聯(lián)了骨的形成和血管的形成。這種血管以雙染CD31和Endomucin均陽(yáng)性為特征(CD31+Endomucin+)。在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中，

16、異常的骨質(zhì)增生即異常的異位骨島形成在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程中起了重要的作用。軟骨下骨異位骨島改變了關(guān)節(jié)內(nèi)的受力環(huán)境，使軟骨經(jīng)受異常的力學(xué)刺激，而引起關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的破壞及軟骨的退行性病變。CD31+Endomucin+血管是一種特異的偶聯(lián)骨形成的血管。因?yàn)槲覀冋J(rèn)為在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程中，軟骨下骨異位骨島的形成伴隨著CD31+Endomucin+血管的形成，因其偶聯(lián)骨形成。綜上所述，常山酮可以通過(guò)抑制異常血管的形成來(lái)調(diào)節(jié)軟骨下骨的骨重塑并最終緩

17、解骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。
　　結(jié)論：
　　1.常山酮緩解了關(guān)節(jié)軟骨的破壞從而延緩了骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，這一作用是通過(guò)調(diào)節(jié)軟骨下骨的異常的骨重塑抑制軟骨下骨異位骨島的形成來(lái)實(shí)現(xiàn)的;
　　2.常山酮抑制了軟骨下骨Th17細(xì)胞從而減少了軟骨下骨異常增多的骨吸收進(jìn)而減少了過(guò)多的活性的TGF-β的釋放;
　　3.常山酮抑制了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs的TGF-β依賴的smad2/3信號(hào)通路。
　　4.常山酮抑制了軟骨下骨異常