線粒體遺傳背景下骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis OA)是與年齡相關(guān)的最常見的關(guān)節(jié)性疾病。有研究發(fā)現(xiàn)OA的發(fā)生與線粒體單倍型相關(guān)，所謂線粒體單倍型本質(zhì)上指代線粒體DNA(mtDNA)多態(tài)性，指含有某一多態(tài)模式的一個(gè)集合。有文獻(xiàn)報(bào)道歐洲人群中單倍型J能夠降低OA的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，且不易惡化，而單倍型U能夠提高OA的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，且易惡化。而課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)單倍型G是OA發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因子，單倍型B4是OA發(fā)生的保護(hù)性因子，通過構(gòu)建僅線粒

2、體DNA不同而核背景完全相同的細(xì)胞模型來探討線粒體遺傳背景下骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生機(jī)制。
　　目的：
　　1、根據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選特定單倍型B4，G兩個(gè)單倍型的個(gè)體，抽取外周血，提取血小板，用來構(gòu)建相應(yīng)的細(xì)胞模型。
　　2、檢測(cè)B4，G兩種單倍型細(xì)胞模型的線粒體功能差異性，揭示線粒體遺傳學(xué)背景對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展機(jī)制影響。
　　3、由于軟骨細(xì)胞處于低氧環(huán)境，主要能量來源是糖酵解，檢測(cè)兩種單倍型細(xì)胞模型的糖酵解水平，

3、探討線粒體單倍型在能量代謝中所起到的作用。
　　4、探討B(tài)4，G單倍型在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中的作用及其臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　方法：
　　1、根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，線粒體單倍型B4是骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的保護(hù)性因子，而單倍型G是其發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因子，收集同一地區(qū)、健康人的外周血，提取全基因組DNA，篩選特定的B4，G兩個(gè)單倍型個(gè)體。
　　2、抽取B4，G兩單倍型個(gè)體的外周血，分離血小板，與不含線粒體DNA(mtDNA)的143

4、B rho0細(xì)胞融合，構(gòu)建只有線粒體不同而核背景完全相同的細(xì)胞模型。
　　3、PCR擴(kuò)增mtDNA:收集B4，G兩單倍型的細(xì)胞，提取DNA，設(shè)計(jì)24對(duì)重疊連續(xù)引物， PCR擴(kuò)增mtDNA全序， PCR產(chǎn)物直接測(cè)序。
　　4、將B4，G兩單倍型細(xì)胞模型培養(yǎng)至最佳狀態(tài)后，檢測(cè)兩單倍型細(xì)胞模型的線粒體功能，分析B4，G兩單倍型細(xì)胞模型的線粒體功能差異性。
　　1)應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)兩單倍型細(xì)胞模型的復(fù)合體酶活性。
　

5、　2)應(yīng)用ATP檢測(cè)試劑盒分析兩單倍型產(chǎn)生ATP的差異性。
　　3)應(yīng)用ROS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)兩單倍型細(xì)胞模型ROS產(chǎn)生的差異性。
　　4)應(yīng)用非變性膠技術(shù)檢測(cè)到G單倍型細(xì)胞模型的線粒體復(fù)合體Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ的超級(jí)復(fù)合體含量高于B4單倍型.
　　5、應(yīng)用乳酸檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)兩單倍型細(xì)胞模型乳酸產(chǎn)生量的差異性。
　　6、細(xì)胞活性分析:應(yīng)用CCK-8.檢測(cè)液對(duì)B4，G兩單倍型細(xì)胞模型的細(xì)胞活性進(jìn)行分析。
　　7、應(yīng)用N

6、AD+/NADH ratio檢測(cè)試劑盒檢測(cè)B4，G兩單倍型細(xì)胞模型的NAD+/NADH ratio。
　　8、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPSS16.0軟件分析我們所構(gòu)建的B4，G兩單倍型的細(xì)胞模型之間的線粒體功能差異性，以期發(fā)現(xiàn)線粒體單倍型在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　結(jié)果：
　　1、對(duì)B4，G兩單倍型的細(xì)胞模型進(jìn)行復(fù)合體酶活性分析，結(jié)果顯示G單倍型的細(xì)胞模型的復(fù)合體Ⅰ及復(fù)合體Ⅲ的活性顯著高于B4單倍型的細(xì)胞模型，P值均

7、小于0.001。
　　2、常氧情況下，對(duì)B4，G兩單倍型的細(xì)胞模型進(jìn)行ATP產(chǎn)能檢測(cè)，結(jié)果顯示G單倍型的細(xì)胞模型ATP產(chǎn)生量低于B4單倍型的細(xì)胞模型，但無顯著性差異，加入線粒體復(fù)合體Ⅰ抑制劑Rotenone及復(fù)合體Ⅲ抑制劑Antimycin A后，可認(rèn)為抑制了氧化磷酸化產(chǎn)能，此時(shí)的ATP全部來源于糖酵解，兩單倍型的ATP產(chǎn)生量均有顯著性降低，P值均小于0.001;加入Rotenone后，G單倍型的細(xì)胞模型由糖酵解產(chǎn)生ATP的量仍然

8、低于B4單倍型，P＜0.01，加入AntimycinA后，G單倍型的細(xì)胞模型糖酵解產(chǎn)生ATP的量也仍然低于B4單倍型，P＜0.001。
　　3、G單倍型的細(xì)胞模型的線粒體DNA拷貝數(shù)低于B4單倍型，P＜0.05。
　　4、低氧情況下，對(duì)B4，G兩單倍型的細(xì)胞模型進(jìn)行ATP產(chǎn)能檢測(cè)，G單倍型的細(xì)胞模型ATP產(chǎn)生量低于B4單倍型的細(xì)胞模型，P＜0.01。
　　5、應(yīng)用乳酸檢測(cè)試劑盒，G單倍型的細(xì)胞模型產(chǎn)生乳酸的量低于B4單

9、倍型細(xì)胞模型，P＜0.01。
　　6、檢測(cè)B4，G兩單倍型細(xì)胞模型的細(xì)胞活性，低氧環(huán)境下的兩細(xì)胞模型活性相對(duì)于常氧均有下降，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但G單倍型細(xì)胞模型活性低于B4單倍型細(xì)胞模型，P＜0.05。
　　7、加入糖酵解抑制劑2-DG后，B4，G兩單倍型細(xì)胞模型活性均有顯著性降低，P均小于0.001，但G單倍型細(xì)胞模型的細(xì)胞活性顯著低于B4單倍型細(xì)胞模型，P＜0.01。
　　8、對(duì)B4，G兩單倍型的細(xì)胞模型進(jìn)行ROS產(chǎn)能

10、檢測(cè)，常氧情況下，G單倍型細(xì)胞模型產(chǎn)生的ROS低于B4單倍型，P＜0.05，而低氧情況下，G單倍型細(xì)胞模型產(chǎn)生的ROS仍然低于B4單倍型，P＜0.05。
　　9、在常氧與低氧情況下分別加入線粒體復(fù)合體Ⅰ抑制劑Rotenone后檢測(cè)B4，G兩單倍型的ROS水平，常氧情況下兩單倍型的ROS水平無差異，低氧情況下，G單倍型的ROS水平顯著高于B4單倍型，P＜0.001。
　　10、常氧情況下加入NAC，檢測(cè)兩單倍型的ATP生成量，

11、G單倍型細(xì)胞模型的ATP生成量顯著低于B4單倍型，P＜0.01，同時(shí)加入NAC及Rotenone后，兩單倍型的ATP產(chǎn)生量均有顯著性降低，P＜0.001，且G單倍型細(xì)胞模型的ATP量降低相對(duì)于B4單倍型的更明顯，P＜0.01。
　　11、低氧情況下，同時(shí)加入NAC及Rotenone處理細(xì)胞后，G單倍型細(xì)胞模型的ATP產(chǎn)生量顯著低于B4單倍型細(xì)胞模型，P＜0.001。
　　12、應(yīng)用NAD+/NADH ratio檢測(cè)試劑盒檢測(cè)

12、B4，G兩單倍型細(xì)胞模型的NAD+/NADH ratio，結(jié)果顯示G單倍型細(xì)胞模型的NAD+/NADH ratio顯著低于B4單倍型，P＜0.01。
　　13、加入Rotenone抑制劑后，G單倍型細(xì)胞模型產(chǎn)生ATP的量顯著低于B4單倍型，同時(shí)加入Rotenone和NAM后，ATP產(chǎn)生量均有顯著性升高，但G單倍型升高的更為明顯，P＜0.001，同時(shí)加入Rotenone和FK866后，ATP產(chǎn)生量均有顯著性降低，但B4單倍型降低的更

13、為顯著，P＜0.001。
　　結(jié)論：
　　1、根據(jù)對(duì)B4，G兩單倍型細(xì)胞模型的復(fù)合體酶活性檢測(cè)，ATP水平檢測(cè)，由上述的1-4實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，對(duì)于我們所構(gòu)建的B4，G兩單倍型細(xì)胞模型，G單倍型細(xì)胞模型的線粒體功能要優(yōu)于B4單倍型細(xì)胞模型。
　　2、通過對(duì)B4，G兩單倍型細(xì)胞模型的乳酸水平檢測(cè)，低氧條件下細(xì)胞活性檢測(cè)及加入糖酵解抑制劑后對(duì)細(xì)胞活性的檢測(cè)，由上述的5-7實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)于我們所構(gòu)建的B4，G兩單倍型細(xì)胞模型，G單

14、倍型細(xì)胞模型的糖酵解水平低于B4單倍型，且B4單倍型細(xì)胞模型更適合在低氧環(huán)境下生存。
　　3、通過對(duì)B4，G兩單倍型細(xì)胞模型的不同條件下ROS水平檢測(cè)，由上述的8-11實(shí)驗(yàn)結(jié)果，ROS雖然是能量代謝的主要誘發(fā)因子，但對(duì)于我們所構(gòu)建的B4，G兩單倍型細(xì)胞模型，ROS并不是引起這兩種細(xì)胞模型代謝改變的誘發(fā)因子。
　　4、由于我們所構(gòu)建的B4，G兩單倍型細(xì)胞模型的核背景完全一致，僅線粒體不同，通過對(duì)兩單倍型的NAD+/NADH r