FGFR3胞內(nèi)區(qū)相互作用蛋白質(zhì)的篩選.pdf

1、FGFR3與骨骼發(fā)育密切相關(guān)，是長(zhǎng)骨生長(zhǎng)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。FGFR3基因激活型突變與多種骨骼發(fā)育性疾病有關(guān)。除PLC-γ和FRS2等外，目前對(duì)能夠與FGFR3直接發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)還知之甚少。本課題利用酵母雙雜交技術(shù)篩選能夠與FGFR3胞內(nèi)段發(fā)生相互作用的分子，為今后研究FGFR3在發(fā)育以及相關(guān)疾病發(fā)生過(guò)程中的作用提供新的研究方向。 主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果 1.GAL4DNA-BD/R3-ID融合蛋白酵母表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

2、 采用PCR擴(kuò)增獲得FGFR3胞內(nèi)區(qū)的cDNA片段(FGFR3intracellulardomain，R3-ID)。將R3-ID克隆到帶有GAL4DNA-BD基因的克隆載體pGBKT7DNA-BD上，與GAL4DNA-BD基因構(gòu)成融合基因，獲得pGBKT7DNA-BD/R3-ID重組質(zhì)粒。DNA測(cè)序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒中FGFR3胞內(nèi)區(qū)的cDNA堿基序列和閱讀框架均正確。 2.GAL4AD/文庫(kù)的擴(kuò)增、自主報(bào)告基因活化、酵母細(xì)胞毒

3、性及His遺漏表達(dá)檢測(cè)按文庫(kù)操作說(shuō)明擴(kuò)增文庫(kù)，采用堿裂解法抽提，聚乙二醇沉淀法純化，獲得大量高純度的文庫(kù)質(zhì)粒。 將重組質(zhì)粒pGBKT7DNA-BD/R3-ID轉(zhuǎn)化入AH109酵母菌中，在SD/-Trp選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，并與對(duì)照pGBKT7DNA-BD比較，結(jié)果表明細(xì)胞生長(zhǎng)良好，菌落大小與對(duì)照一致，說(shuō)明融合蛋白對(duì)AH109酵母菌無(wú)毒性。檢測(cè)AH109酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化株β-半乳糖苷酶表達(dá)，結(jié)果顯示，pGBKT7DNA-

4、BD/R3-ID重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化株不表達(dá)β-半乳糖苷酶，提示R3-ID無(wú)自主報(bào)告基因激活活性。AH109酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株不能在SD/-His平板上生長(zhǎng)，無(wú)His遺漏表達(dá)。 3.FGFR3胞內(nèi)區(qū)相互作用蛋白質(zhì)篩選 用LiAc/PEG法先將重組質(zhì)粒pGBKT7DNA-BD/R3-ID轉(zhuǎn)化至AH109酵母菌，再用電穿孔法將文庫(kù)質(zhì)粒依次共轉(zhuǎn)化AH109酵母菌，在SD/-Trp/-Leu/-His選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果篩選出68個(gè)陽(yáng)性

5、候選克隆。經(jīng)SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade選擇培養(yǎng)基進(jìn)一步篩選，47個(gè)陽(yáng)性候選克隆被淘汰。分析剩余陽(yáng)性候選克隆的β-半乳糖苷酶活性，共獲得7個(gè)表達(dá)β-半乳糖苷酶克隆。 采用酵母交配法，將陽(yáng)性候選克隆分別與pGBKT7DNA-BD、pGBKT7DNA-BD/R3-ID和pGBKT7-Lam質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化入Y187酵母菌，對(duì)7個(gè)候選陽(yáng)性候選克隆進(jìn)行排除假陽(yáng)性的鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅有3個(gè)陽(yáng)性候選克隆能特異地識(shí)別FGFR3胞內(nèi)區(qū)