乙型肝炎重癥化過程中microRNA-210的改變及功能研究.pdf

1、研究目的：
　　乙型重型肝炎病死率高，預后差。尋找可用于早期預示和早期診斷重型肝炎發(fā)生的分子標志物是目前病毒性肝炎研究的熱點之一。越來越多的證據(jù)表明循環(huán)microRNAs(cir-miRNAs)可能作為潛在的疾病診斷生物標志物。本課題旨在研究乙型肝炎重癥化過程中血清miRNA表達譜的變化以篩選差異表達的microRNA-210（miRNA-210）、評價血清miR-210水平與乙型肝炎重癥化進程的關聯(lián)關系、探討miR-210在乙型

2、肝炎重癥化過程中的潛在功能及其作用機制，為乙型肝炎重癥化的早期預測、預防和治療提供新型靶標。
　　研究方法：
　　1 miRNA芯片實驗
　　(1) miRNA表達譜分析:
　　用TaqMan(R) Human MicroRNA Array A分析健康人混合血清樣本（10例等體積混合）、慢乙肝輕度病人混合血清樣本（10例等體積混合）、乙型慢加急肝衰竭病人混合血清樣本（10例等體積混合）的miRNAs表達譜。

3、>　　(2)篩選差異表達miRNAs:
　　以(Ct＜35)且(|△△Ct|≥2)為判定標準，初步篩選可擴增檢測到的差異表達的miRNAs。
　　(3)候選miR-210的選擇:
　　以(Ct＜35)且(△△Ct≤-2)為判定標準，進一步篩選隨著乙型肝炎病情嚴重程度表達水平升高的miR-210用于單樣本RT-qPCR驗證。
　　2人群調(diào)查
　　(1)血清樣本:
　　30例慢乙肝輕度病人血清、30例慢乙

4、肝重度病人血清、30例乙型慢加急肝衰竭病人血清及30例健康對照血清。
　　(2) miR-210的再驗證:
　　針對miRNA芯片篩選出來的差異表達的miR-210進行單樣本RT-qPCR驗證。
　　(3)其他檢測指標:
　　肝功能(ALT、AST、TBIL、PTA)，血清HBV標記物，病毒載量。
　　3動物實驗
　　經(jīng)小鼠尾靜脈注射Con A(20 mg/kg)制備小鼠急性肝衰竭模型，并于注射后6、

5、12、24小時處死動物，收集外周血和肝組織，檢測下列指標:
　　(1)缺氧探針染色:檢測缺氧肝細胞。
　　(2)熒光定量PCR:檢測肝組織和血清miR-210水平。
　　(3)熒光定量PCR:檢測小鼠肝組織miR-210靶基因Iscu、Ndufa4、Sdhd、Gpd11和Cox10 mRNA水平。
　　4.體外實驗
　　HepG2.2.15細胞分別轉(zhuǎn)染空白對照（DEPC水）、模擬物陰性對照和miR-210模

6、擬物后，缺氧培養(yǎng)24 h或48 h后檢測下列指標:
　　(1) CCK8 assay:檢測HepG2.2.15細胞線粒體脫氫酶活性。
　　(2)病毒學指標檢測:培養(yǎng)基上清HBsAg、HBeAg、HBV DNA拷貝數(shù);HepG2.2.15細胞內(nèi)HBsAg mRNA水平。
　　研究結(jié)果：
　　1 miRNA芯片實驗結(jié)果
　　(1)血清中可檢測到miRNA的數(shù)量和表達水平隨著病情進展顯著增加。
　　(2)乙

7、型肝炎病人血清let-7b等20個miRNAs表達水平顯著高于健康對照組。
　　(3)血清中miR-210、miR-324-5p、miR-423-5p表達水平隨著病情進展顯著升高。
　　2人群調(diào)查結(jié)果
　　(1)輕/重度乙型肝炎和乙型慢加急肝衰竭病人血清中miR-210的水平顯著高于健康對照組(P＜0.05)，血清中miR-210表達水平隨著乙型肝炎病情進展顯著性升高。
　　(2)慢性乙型肝炎患者血清miR-21

8、0水平與ALT/AST水平及血清總膽紅素水平呈正相關(P＜0.05)，與凝血酶原活動度呈負相關(P＜0.05)。
　　3動物實驗結(jié)果
　　(1)小鼠肝衰竭進程存在動態(tài)缺氧現(xiàn)象。ConA暴露6h組和12h組小鼠肝細胞缺氧率顯著性增加(P＜0.05)，Con A暴露24 h組小鼠肝細胞缺氧率顯著高于0h組(P＜0.05)，但低于6h和12h組（P＜0.05）。
　　(2)小鼠肝組織和血清miR-210表達水平隨著病情進展顯

9、著升高。
　　(3)小鼠肝衰竭進程miR-210靶基因Iscu、Ndufa4、Sdhd、Gpd11和Cox10mRNA表達水平顯著性減少（P＜0.05）。
　　4細胞實驗結(jié)果
　　(1)缺氧條件下miR-210過表達抑制HepG2.2.15細胞線粒體脫氫酶活性。
　　(2)缺氧條件下miR-210過表達抑制HBV DNA復制和HBsAg表達。
　　研究結(jié)論：
　　1.miRNA表達譜芯片結(jié)果顯示:乙型