乙型肝炎病毒感染過(guò)程中白介素32表達(dá)水平的研究.pdf

1、目的：
　　乙型肝炎在全世界廣泛流行每年至少有一百萬(wàn)人死于此病,同時(shí)也是影響我國(guó)全體國(guó)民身體健康最大的疾病之一。乙型肝炎病毒感染是導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的主要致病因素之一。白介素32(IL-32)是一種促炎細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)免疫細(xì)胞(單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)分泌炎性細(xì)胞因子,如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-6的分泌。本研究致力于研究乙型肝炎病毒感染過(guò)程當(dāng)中與白細(xì)胞介素-32(白介素-32,IL-32)的相互關(guān)系及其相關(guān)性,旨

2、在闡明IL-32被乙型肝炎病毒誘導(dǎo)表達(dá)水平的變化情況,并進(jìn)一步證實(shí)這一炎癥因子在乙型肝炎病毒感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　方法：
　　一、乙型肝炎患者外周血、細(xì)胞及組織中IL-32的檢測(cè)
　　1.通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)以64例乙型肝炎病毒感染者為實(shí)驗(yàn)組，其血清按照不同病毒量進(jìn)行分組，分為高病毒量、中病毒量、低病毒量三組，檢測(cè)被感染者的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白(ALB)及IL-32在

3、血清中的含量；同時(shí)以40例健康人為對(duì)照組，檢測(cè)其丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白(ALB)及IL-32在血清中的含量，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)乙型肝炎患者IL-32的結(jié)果與健康人的結(jié)果進(jìn)行比較并統(tǒng)計(jì)分析；
　　2.通過(guò)外周血單個(gè)核細(xì)胞提取技術(shù)分別提取72例乙型肝炎病毒感染者的PBMC和40例健康人的PBMC，以72例乙型肝炎病毒感染者為實(shí)驗(yàn)組將患者的樣本按照不同病毒量進(jìn)行分組，分為高病毒量、中病毒量、低病

4、毒量三組，檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞中IL-32的mRNA含量，以40例健康人為對(duì)照組，檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞中IL-32的mRNA含量，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)乙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-32的mRNA含量結(jié)果與健康人的外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-32的mRNA含量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；
　　3.通過(guò)免疫組織化學(xué)染色技術(shù)對(duì)23例肝臟部分切除患者的肝臟組織進(jìn)行染色，利用顯微鏡，觀察鏡下肝臟組織中IL-32化學(xué)染色情況，并拍照進(jìn)行比較分析；
　　二、HepG

5、2細(xì)胞模型中IL-32的檢測(cè)
　　1.通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，將HepG2肝細(xì)胞系細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)，分別使用乙型肝炎病毒含量不同的患者血清和健康人血清對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激，將無(wú)血清刺激組作為對(duì)照組，有血清刺激組作為實(shí)驗(yàn)組，采用ELISA實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中IL-32的含量，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；
　　2.通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，將HepG2肝細(xì)胞系細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，分別使用乙型肝炎病毒含量不同的患者血清和健康人血清對(duì)細(xì)

6、胞進(jìn)行刺激，將無(wú)血清刺激組作為對(duì)照組，有血清刺激組作為實(shí)驗(yàn)組，用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中IL-32mRNA表達(dá)情況，將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；
　　3.通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，分別使用乙型肝炎病毒含量不同的患者血清和健康人血清對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激，將無(wú)血清刺激組作為對(duì)照組，有血清刺激組作為實(shí)驗(yàn)組，將細(xì)胞進(jìn)行固定、石蠟包埋后組織切片進(jìn)行IL-32免疫組織化學(xué)染色，觀察不同病毒含量的血清進(jìn)行刺激后細(xì)胞中IL-32的表達(dá)情況，利用

7、顯微鏡觀察鏡下肝臟組織中IL-32化學(xué)染色情況，并拍照進(jìn)行比較分析；
　　結(jié)果：
　　一、乙型肝炎患者外周血及組織中IL-32的檢測(cè)
　　1.血清IL-32 ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組乙型肝炎感染患者病毒含量高、中、低組IL-32的含量與健康人對(duì)照組有明顯差異（p<0.05），同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)高病毒含量組的IL-32與中、低病毒含量組都有明顯差異（p<0.05）；
　　2.外周血PBMC中IL-32 mRNA含量

8、檢測(cè)表明，實(shí)驗(yàn)組乙型肝炎感染患者病毒含量中、低組IL-32 mRNA的含量與健康人對(duì)照組有明顯差異（p<0.05），同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)高病毒含量組的IL-32 mRNA的含量與中、低病毒含量組都有明顯差異（p<0.05）；
　　3.IL-32免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明23例臨床肝臟組織切片中，炎癥組織中IL-32明顯著色，IL-32表達(dá)明顯增高而正常組織中著色較淺；
　　二、HepG2細(xì)胞模型中IL-32的檢測(cè)
　　1.Hep

9、G2細(xì)胞乙肝病毒不同病毒量刺激組和陰性血清刺激ELISA結(jié)果表明，高、中、低病毒含量刺激的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-32與陰性血清刺激組比較有明顯差異（p<0.05），高病毒含量組與中、低病毒含量組比較都有明顯差異（p<0.05），對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均存在顯著差異(p<0.05)；
　　2.HepG2細(xì)胞經(jīng)過(guò)乙肝病毒不同病毒量刺激組和陰性血清刺激組IL-32mRNA的結(jié)果表明，高、中、低病毒含量刺激的細(xì)胞中的IL-32mRNA與陰性血清

10、刺激組比較有明顯差異（p<0.05），實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組也存在明顯差異（p<0.05）；
　　3.HepG2細(xì)胞經(jīng)過(guò)乙肝病毒不同病毒量刺激組和陰性血清刺激組，IL-32免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，高病毒刺激組與未受血清刺激組著色基本無(wú)差異，而與中、低病毒含量及陰性血清刺激組著色存在明顯差異；
　　結(jié)論：
　　1.在乙型肝炎在活動(dòng)期時(shí)隨著HBVDNA含量的不同，IL-32在血清中含量降低，其中病毒含量較高時(shí)降低更為顯著，外周血