LSD1在乙型肝炎病毒感染中的作用及機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)簡稱乙肝病毒,屬于嗜肝DNA病毒科(Hepadnavividae),是一種逆轉(zhuǎn)錄DNA病毒。HBV感染的致病機制涉及病毒和機體兩方面——乙型肝炎病毒在感染肝細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制增殖所致細(xì)胞損傷有限,而宿主的細(xì)胞免疫應(yīng)答引起的免疫病理變化是導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷的主要因素。在乙肝病毒所致的急性和慢性感染時,機體免疫狀態(tài)不同。急性乙肝患者體內(nèi)輔助性T細(xì)胞1類細(xì)胞(Helper T cell1,Th1

2、)應(yīng)答模式占優(yōu)勢,上升的Th1類細(xì)胞因子促進細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T cell,CTL)參與乙肝病毒的清除;而慢性乙肝患者體內(nèi)存在明顯的Th1/輔助性T細(xì)胞2(Helper T cell2,Th2)平衡漂移,表現(xiàn)為Th1類細(xì)胞因子減少,Th2類細(xì)胞因子增加。
  組蛋白賴氨酸去甲基化酶1(Lysine specific demethylase1,LSD1)是一種黃素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine d

3、inμlcleotide,F(xiàn)AD)依賴性單胺氧化酶,LSD1定位于細(xì)胞核內(nèi),可特異性脫去單甲基化和二甲基化組蛋白H3第4位賴氨酸(Histone3 lysine4,H3K4)和H3第9位賴氨酸(Histone3 lysine9,H3K9)位點上的甲基基團,動態(tài)調(diào)節(jié)組蛋白的甲基化狀態(tài),影響組蛋白和其他功能蛋白的相互作用,進而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的激活和抑制。
  本課題從CHB患者和動物模型兩方面探討LSD1與Th1/Th2平衡漂移,進而影

4、響HBV清除的關(guān)系,研究LSD1在乙肝病毒感染中的作用及機制。為進一步闡明CHB發(fā)病機制及免疫治療靶點提供理論和實驗依據(jù)。
  第一部分 LSD1在HBV感染中的作用及機制研究
  目的:本部分實驗旨在了解CHB患者外周血CD4+Th細(xì)胞LSD1表達(dá)水平與Th1/Th2平衡漂移的關(guān)系,探討LSD1介導(dǎo)的組蛋白修飾對CHB患者CD4+Th細(xì)胞分化的作用,觀察LSD1抑制劑反苯環(huán)丙胺(Tranylcypromine,TCP)對C

5、D4+Th細(xì)胞Th1/Th2分化的影響,探討TCP在調(diào)控Th1/Th2分化平衡中的作用及機制。
  方法:248名2011年1月至2014年6月在南通大學(xué)附屬醫(yī)院住院CHB患者和206名健康體檢者作為對照進行實驗。觀察CHB患者的外周血CD4+Th細(xì)胞中LSD1表達(dá)水平、血清中IFN-γ和IL-4水平;TCP干預(yù)后Th1、Th2細(xì)胞頻率和Th1型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子T-bet、調(diào)控因子磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子1(Phosphoryla

6、tedsignal transducers and activators of transcription,pSTAT1)以及二甲基組蛋白H3賴氨酸4(Dimethylation ofhistone3 lysine4,H3 K4me2)表達(dá)狀況。
  1.根據(jù)入院時的肝功能、HBV兩對半及HBV-DNA定量的檢驗結(jié)果,將248例CHB患者分為四組:(1)乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HB

7、sAg)高水平組(HBsAg>250 IU/ml)與低水平組(HBsAg≤,250 IU/ml);(2)乙型肝炎e抗原(Hepatitis B eantigen,HBeAg)陽性組與陰性組。
  2.采用密度梯度離心法分離CHB患者和對照組外周血淋巴細(xì)胞,免疫磁珠法分選CD4+Th細(xì)胞和流式細(xì)胞儀檢測CD4+Th細(xì)胞的純度。提取CHB患者和對照組CD4+Th細(xì)胞總蛋白,蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot,WB)檢測LSD1

8、表達(dá)。采用ELISA法檢測CHB患者和對照組血清中IFN-γ和IL-4含量。
  結(jié)果:對照組CD4+ Th細(xì)胞純度為(96.9±2.3)%,CHB患者組CD4+ Th細(xì)胞純度為(96.5±2.5)%,兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 CHB組外周血CD4+Th細(xì)胞LSD1表達(dá)水平高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。CHB患者各組外周血CD4+Th細(xì)胞LSD1表達(dá): HBsAg高水平組>低水平組;HBeAg陽性組>陰性組;ALT高

9、水平組<低水平組;HBV-DNA高載量組>HBV-DNA低載量組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
  結(jié)論:1.CHB患者外周血CD4+ Th細(xì)胞LSD1表達(dá)水平高于對照組,且實驗組中代表HBV感染程度的HBsAg、 HBeAg、HBV-DNA載量高水平組,其LSD1表達(dá)水平高于各指標(biāo)的低水平組。在顯示肝組織損傷程度的ALT低水平組,LSD1表達(dá)量高于ALT高水平組,提示LSD1的低表達(dá)有利于Th1細(xì)胞分化并能上調(diào)細(xì)胞免疫應(yīng)答,產(chǎn)生效應(yīng)性細(xì)

10、胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL),導(dǎo)致大量被HBV感染的肝細(xì)胞損傷,釋放過量ALT至外周血。
  2.CHB患者外周血中Th1型細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)水平低于對照組,與外周血CD4+ Th細(xì)胞LSD1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),實驗組中HBsAg、 HBeAg、 HBV-DNA載量高水平組,IFN-γ均低于各指標(biāo)低水平組;Th2型細(xì)胞因子IL-4則均無明顯變化。以上結(jié)果提示LSD1可通過影響Th1分化

11、,導(dǎo)致CHB患者Th1/Th2平衡漂移。
  3.TCP干預(yù)后,IFN-γ陽性細(xì)胞頻率明顯高于對照組,Th1型特異轉(zhuǎn)錄因子T-bet表達(dá)明顯增加,上游調(diào)控因子STAT1磷酸化(pSTAT1)水平顯著增加,提示其通過T-bet/STAT1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制LSD1的活性;LSD1的底物H3K4me2表達(dá)水平上升,進一步證實TCP是良好的LSD1活性抑制劑。
  綜上所述,本研究結(jié)果表明LSD1高表達(dá)是CHB患者體內(nèi)Th1分化水平

12、下降、Th1/Th2分化失衡并導(dǎo)致對HBV清除或抑制HBV復(fù)制能力減弱的原因之一。提示LSD1高表達(dá)參與了慢性HBV感染的致病過程,調(diào)節(jié)LSD1表達(dá)可成為針對HBV感染的潛在治療靶點。
  第二部分 下調(diào)LSD1對HBV感染小鼠模型的作用及機制研究
  目的:通過小鼠尾靜脈高壓注射HBV1.3倍長重組質(zhì)粒建立HBV小鼠模型。使用TCP和LSD1 siRNA下調(diào)HBV小鼠模型體內(nèi)LSD1的表達(dá),通過觀察HBV小鼠模型體內(nèi)HBV

13、抗原和DNA的變化及組織病理學(xué)檢測的改變,判斷下調(diào)LSD1對HBV模型小鼠清除HBV的影響。通過觀察HBV模型小鼠與TCP和LSD1 siRNA處理小鼠脾臟來源的淋巴細(xì)胞中LSD1的表達(dá)變化,及體外轉(zhuǎn)染骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells, DC)細(xì)胞中LSD1的表達(dá)情況和表型的改變,探討其作用機制。檢測外周血和脾臟CD4+ Th細(xì)胞IFN-γ和IL-4的表達(dá),觀察小鼠脾細(xì)胞Th1相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子T-bet和pSTAT

14、1以及LSD1、H3K4me2的表達(dá)水平的變化;探討LSD1酶活性改變與HBV感染小鼠免疫細(xì)胞Th1/Th2平衡漂移的關(guān)系以及抑制LSD1酶活性對HBV感染病毒清除的影響及機制。
  方法:1.將100μg重組的HBV1.3倍長重組質(zhì)粒經(jīng)尾靜脈高壓注射BALB/C小鼠,建立HBV小鼠感染模型。(1)4d后ELISA法檢測小鼠血清HBsAg;(2)實時定量PCR檢測HBV-DNA載量;(3)HE染色觀察肝細(xì)胞變化;(4)免疫組化檢測

15、肝組織HBsAg、 HBcAg和HBeAg分布,確定HBV感染小鼠模型的建立。
  2.將BALB/C小鼠隨機分成4組,每組20只:對照組(僅尾靜脈注射1 ml生理鹽水);模型組(尾靜脈注射HBV1.3倍長重組質(zhì)粒與等體積生理鹽水);LSD1siRNA組(尾靜脈注射HBV1.3倍長重組質(zhì)粒與等體積溶解50μg LSD1 siRNA的生理鹽水);TCP組(尾靜脈注射HBV1.3倍長重組質(zhì)粒與等體積溶解TCP終濃度為60μM的生理鹽水

16、)。對各組小鼠(1)采用全自動微粒子化學(xué)發(fā)光法檢測外周血第0d、4d、8d和12 d HBsAg的表達(dá)情況;(2)實時定量PCR檢測HBV-DNA載量。
  結(jié)果:尾靜脈高壓注射HBV1.3倍長重組質(zhì)粒小鼠4天后,檢測發(fā)現(xiàn)(1)外周血HBsAg陽性;(2) HBV-DNA載量達(dá)到最高峰;(3)肝細(xì)胞無明顯病理改變;(4)肝組織中HBsAg廣泛存在,HBcAg和HBeAg未見分布,說明HBV感染模型構(gòu)建成功。
  結(jié)論:1.用

17、尾靜脈高壓注射HBV1.3倍長重組質(zhì)??珊啽阌行У臉?gòu)建HBV感染的小鼠模型,為研究HBV感染創(chuàng)造條件。
  2.通過TCP或LSD1 siRNA干預(yù),感染小鼠DC表面與抗原提呈相關(guān)分子MHC-Ⅱ、CD80和CD86表達(dá)水平增高,表明兩種干預(yù)方法均可增強小鼠DC的抗原提呈功能,進而促進HBV清除。
  3.通過TCP或LSD1 siRNA干預(yù):感染小鼠外周血IFN-γ和IFN-γ陽性細(xì)胞頻率均出現(xiàn)明顯增高,提示促進小鼠脾臟Th

18、1/Th2分化平衡向Th1細(xì)胞偏移; Th1型特異轉(zhuǎn)錄因子T-bet表達(dá)明顯增加,上游調(diào)控因子STAT1磷酸化(pSTAT1)程度顯著增加,亦顯示其可調(diào)控CD4+Th細(xì)胞分化向Th1型漂移,機制是通過對T-bet/STAT1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生影響進而抑制了LSD1的活性。
  4.結(jié)果顯示模型對照組和TCP組LSD1的表達(dá)高于LSD1 siRNA組,而模型對照組H3K4me2的表達(dá)低于TCP組和LSD1 siRNA組。表明TCP干預(yù)

19、降低了LSD1的酶活性,使得H3K4me2蛋白的表達(dá)增加,但并未抑制LSD1的表達(dá)。
  綜上所述,本研究應(yīng)用尾靜脈高壓注射HBV1.3倍長重組質(zhì)粒構(gòu)建HBV感染的小鼠模型,用TCP或LSD1 siRNA干預(yù)后,小鼠DC表面與抗原提呈相關(guān)分子MHC-Ⅱ、CD80和CD86表達(dá)水平增高,表明兩種干預(yù)方法均可增強DC的抗原提呈功能,進而促進HBV清除。在感染小鼠體內(nèi)應(yīng)用TCP或LSD1 siRNA干預(yù)后,促進了脾臟Th1/Th2分化平

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