MICRORNA-210對(duì)周圍神經(jīng)再生的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:周圍神經(jīng)損傷是生活工作中的常見(jiàn)疾病，病理表現(xiàn)為胞體腫大，尼氏體溶解或消失，修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的關(guān)鍵是神經(jīng)元胞體的存活及軸突的延伸，神經(jīng)軸突的再生與神經(jīng)細(xì)胞胞體相應(yīng)的基因表達(dá)及沿軸突相應(yīng)分子的合成密切相關(guān)，近年來(lái)運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)治療周圍神經(jīng)損傷已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，本課題主要研究microrna-210對(duì)周圍神經(jīng)軸突再生的影響作用及microrna-210對(duì)DRG(背根神經(jīng)節(jié)Dorsal Root Ganglion)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的影響，探

2、討microrna-210及與其潛在下游EFNA3（Ephrin-A3即絡(luò)氨酸蛋白激酶A3）的關(guān)系，確定microrna-210對(duì)軸突生長(zhǎng)的作用機(jī)制，為周圍神經(jīng)損傷治療提供新思路和新方法。
　　方法:實(shí)驗(yàn)對(duì)象為8-10周齡清潔級(jí)小白鼠共60只，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)各30只，雌雄不限，體重40-50g。運(yùn)用體內(nèi)及體外的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染技術(shù)將microRNA-210質(zhì)粒(miR-210)或microRNA-210抑制劑(Anti-210)

3、等電轉(zhuǎn)染入DRG細(xì)胞及DRG組織，利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)MicroRNA-210對(duì)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)的影響及對(duì)細(xì)胞凋亡的作用。
　　1、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn):清潔級(jí)小白鼠（8-10周）經(jīng)脫頸處死后，嚴(yán)格按照無(wú)菌操作于顯微鏡下取出小白鼠脊柱兩側(cè)所有的DRG置于MEM無(wú)血清培養(yǎng)基中，消化DRG組織得到DRG細(xì)胞并進(jìn)行質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染，根據(jù)DRG細(xì)胞電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的不同分為5組;A組為對(duì)照組（EGFP質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染組）;B組為miR-210組（即:microRNA

4、-210過(guò)量表達(dá)組，microRNA-210與EGFP質(zhì)粒1∶1混合轉(zhuǎn)染）;C組為Anti-210組（即:microRNA-210抑制劑與EGFP質(zhì)粒1:1混合轉(zhuǎn)染）;D組為siEFNA3組(EFNA3相應(yīng)的sirna組，sirna能敲出DRG細(xì)胞的EFNA3，從而下調(diào)EFNA3的表達(dá));E組為Anti-210+siEFNA3組（即:microRNA-210抑制劑與EFNA3的sirna混合組）。電轉(zhuǎn)染3天后將各組細(xì)胞進(jìn)行TUJ1免疫組

5、織化學(xué)染色，rt-pcr檢測(cè)細(xì)胞中microRNA-210含量，Western-Blot測(cè)定microRNA-210及其下游EFNA3(Ephrin-A3即絡(luò)氨酸蛋白激酶A3)的含量，Tunel染色測(cè)定各組凋亡細(xì)胞數(shù)量并進(jìn)行caspase-3含量檢測(cè)，在熒光顯微鏡下測(cè)量DRG神經(jīng)細(xì)胞軸突的長(zhǎng)度，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組間數(shù)據(jù)的差異。
　　2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):同體外實(shí)驗(yàn)分組一樣，根據(jù)電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的不同將30只小鼠分為5組，每組6只，用氯胺酮（10mg

6、/kg）和甲苯噻嗪(10mg/kg)進(jìn)行腹腔注射麻醉，在顯微鏡下剝離皮下組織和脊椎旁肌肉，暴露L4及L5背根神經(jīng)節(jié)，用國(guó)際先進(jìn)的體內(nèi)電轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。DRG電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)2天后，再次進(jìn)行腹腔注射麻醉，解剖暴露小鼠左側(cè)坐骨神經(jīng)，在距離其神經(jīng)根部2mm處用顯微鑷反復(fù)鉗夾神經(jīng)干建立坐骨神經(jīng)損傷模型，小鼠坐骨神經(jīng)擠壓傷3天后，脫頸處死小鼠并用4％福爾馬林(PFA)注射其左心室灌注固定，取出左下肢及脊柱，仔細(xì)分離固定標(biāo)本的肌肉組織取出小鼠坐骨神

7、經(jīng)及與其相連的L4及L5 DRG組織。Mount液固定封閉標(biāo)本，在熒光顯微鏡下測(cè)量各組坐骨神經(jīng)擠壓傷標(biāo)記處至軸突生長(zhǎng)末端的長(zhǎng)度。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較各組坐骨神經(jīng)軸突再生長(zhǎng)度數(shù)據(jù)。
　　3、本課題還進(jìn)行體內(nèi)坐骨神經(jīng)損傷再生速度的測(cè)量實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)取8-10周齡清潔級(jí)小白鼠共48只，雌雄不限，體重40-50g。同樣先進(jìn)行小鼠體內(nèi)綠色熒光蛋白EGFP質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染DRG的實(shí)驗(yàn)，電轉(zhuǎn)染成功后2天建立坐骨擠壓傷模型，然后以小鼠坐骨神經(jīng)擠壓傷后的不同時(shí)間

8、為時(shí)間節(jié)點(diǎn)處死小鼠，可將小鼠分為傷后12小時(shí)，18小時(shí)，1天，2天，3天，4天，5天，6天的8組（每組6只），取出坐骨神經(jīng)制成標(biāo)本，在熒光顯微鏡下測(cè)量坐骨神經(jīng)擠壓傷標(biāo)記處至軸突生長(zhǎng)末端的長(zhǎng)度，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較各組坐骨神經(jīng)軸突再生長(zhǎng)度數(shù)據(jù)，為體內(nèi)神經(jīng)再生速度制定標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果:1、與對(duì)照組相比，無(wú)論是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還是體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，miR-210組的神經(jīng)軸突均明顯長(zhǎng)于對(duì)照組，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　2、Weste

9、rn-bolt顯示當(dāng)抑制microRNA-210表達(dá)時(shí)，Anti-210組的EFNA3含量與對(duì)照組相比明顯增高(P＜0.05)。
　　3、Western-bolt顯示當(dāng)過(guò)量表達(dá)microRNA-210時(shí)，miR-210組的EFNA3含量與對(duì)照組相比明顯降低(P＜0.05)。
　　4、與對(duì)照組相比，無(wú)論是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還是體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，Anti-210組的神經(jīng)軸突均明顯短于對(duì)照組，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　5

10、、siEFNA3組的神經(jīng)軸突長(zhǎng)度與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。Anti-210+siEFNA3組的神經(jīng)軸突長(zhǎng)度與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　6、Tunel免疫熒光染色顯示過(guò)量表達(dá)microRNA-210時(shí)，miR-210組的凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯少于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　7、Western-bolt顯示過(guò)量表達(dá)microRNA-210時(shí)，miR-210組的凋亡蛋白Caspase-3和Cleaved-

11、Caspase3的含量均低于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　8、體內(nèi)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)速度測(cè)量實(shí)驗(yàn)顯示坐骨神經(jīng)擠壓術(shù)后12小時(shí)軸突平均生長(zhǎng)0.32±0.06mm;18小時(shí)后軸突生長(zhǎng)0.43±0.04mm;1天后軸突生長(zhǎng)0.68±0.08mm;2天后軸突生長(zhǎng)1.59±0.1mm;3天后軸突生長(zhǎng)3.43±0.2mm;4天后軸突生長(zhǎng)5.14±0.6mm;5天后軸突生長(zhǎng)6.10±0.8mm;6天后軸突生長(zhǎng)8.07±0.9mm;
　　結(jié)論:1

12、、microRNA-210可以促進(jìn)神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)，抑制DRG神經(jīng)元microRNA-210的表達(dá)會(huì)阻礙神經(jīng)軸突的再生。2、EFNA-3是microRNA-210的下游因子，而microRNA-210與EFNA3成負(fù)相關(guān)關(guān)系，microRNA-210表達(dá)升高時(shí)，EFNA3表達(dá)量會(huì)減低，而microRNA-210表達(dá)下降時(shí)，EFNA3表達(dá)量會(huì)增高。3、相應(yīng)的下調(diào)EFNA3的表達(dá)會(huì)逆轉(zhuǎn)microRNA-210被抑制后對(duì)神經(jīng)軸突再生的阻礙作用，

13、而單獨(dú)下調(diào)EFNA3的表達(dá)則對(duì)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)無(wú)影響。4、Tunel染色顯示microRNA-210會(huì)抑制DRG神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，同時(shí)Western-bolt實(shí)驗(yàn)顯示microRNA-210可以減低凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的凋亡。5、microRNA-210及其下游EFNA-3對(duì)促進(jìn)神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)與抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡起著重要的作用。6、體內(nèi)坐骨神經(jīng)軸突以每天1-1.5mm的速度再生，感覺(jué)神經(jīng)再生速度的數(shù)據(jù)為軸突再生研究提