MicroRNA-210對缺氧狀態(tài)下腎癌細胞增殖、凋亡和侵襲的影響及其分子機制研究.pdf

1、第一章microRNA-210在腎臟透明細胞癌中的表達及其與臨床病理分期、分級的相關(guān)性研究目的:探討microRNA-210(miR-210)在腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)中的表達及其意義。
　　方法:用實時定量PCR技術(shù)檢測15例ccRCC及癌旁非腫瘤組織中miR-210的表達情況,研究其與ccRCC病理分期、分級之間的關(guān)系。
　　結(jié)果:實時定量PCR發(fā)現(xiàn),15

2、例ccRCC患者與配對的癌旁非腫瘤組織相比,miR-210在腫瘤組織中的表達100％上調(diào),其中miR-210在ccRCC中的相對表達量為7.16±0.63,在癌旁非腫瘤組織中相對表達量2.27±0.54,兩者表達有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)15例ccRCC標本中,根據(jù)病理分期分級進行分組,Ⅰ期腎癌中miR-210的相對表達量為7.24±0.66,Ⅰ-Ⅲ期腎癌中為7.60±0.64,兩者相比沒有顯著差異(P＞0.05)。高分化組腎癌中

3、miR-210的相對表達量為7.06±0.69,中-低分化組腎癌中為7.21±0.63,兩者相比沒有顯著差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:1、ccRCC (?)中miR-210的表達水平較癌旁非腫瘤組織明顯上調(diào),暗示miR-210可能參與ccRCC的發(fā)生發(fā)展,miR-210表達水平的檢測有助于腎癌早期診斷。2、ccRCC中miR-210的表達水平與病理分期分級無關(guān)。
　　目的:miR-210對缺氧狀態(tài)下腎癌細胞細胞增殖、侵襲

4、能力和細胞凋亡等生物學性狀的影響。
　　方法:實時定量PCR檢測常氧、缺氧狀態(tài)下腎癌細胞株(ACHN)中及正常腎小管上皮細胞株(HK2)中miR-210的表達。采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染hsa-mir-210inhibitor于缺氧48h的腎癌細胞株ACHN中,敲低miR-210的表達,實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-210表達,MTT法、Transwell侵襲實驗和Annexin V/PI雙染法分別觀察細胞增

5、殖、侵襲能力及細胞凋亡的變化。結(jié)果:常氧狀態(tài)下正常腎小管上皮細胞株HK2和腎癌細胞株ACHN細胞中miR-210的相對表達量分別為1.47和3.43。缺氧狀態(tài)12h、24h和48h腎癌細胞株ACHN細胞中miR-210的相對表達量分別為4.59、5.30和7.20。腎癌細胞ACHN常氧組,缺氧組,缺氧抑制組3組比較實驗,缺氧抑制組轉(zhuǎn)染sa-mir-210inhibitor,缺氧條件下培養(yǎng)48h后,結(jié)果顯示與缺氧組相比,缺氧抑制組中miR

6、-210的相對表達量顯著降低(P＜0.05)。用MTT法檢測細胞的生長抑制率,細胞侵襲實驗檢測其侵襲能力,流式細胞術(shù)檢測其凋亡率,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染hsa-mir-210inhibitot12h、24h、48h后,在各個時間點和常氧組相比,缺氧組細胞相對存活率顯著升高(P＜0.05);在各個時間點和常氧組及缺氧組相比,缺氧抑制組細胞相對存活率顯著降低(P＜0.05)。
　　Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示在各個時間點和常氧組相比,缺氧組侵

7、襲細胞數(shù)顯著增加(P＜0.05);在各個時間點和常氧組及缺氧組相比,缺氧抑制組侵襲細胞數(shù)顯著減少(P＜0.05)。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡結(jié)果顯示在各個時間點和常氧組相比,缺氧組凋亡率顯著降低(P＜0.05);在各個時間點和常氧組及缺氧組相比,缺氧抑制組凋亡率顯著增高(P＜0.01)。
　　結(jié)論:1、缺氧誘導miR-210在腎癌細胞中表達上調(diào)。2、hsa-mir-210inhibitor能有效的轉(zhuǎn)染于腎癌細胞中,降低腎癌細胞中miR

8、-210的表達。3、缺氧增強腎癌細胞的增殖和侵襲能力,并且減少細胞凋亡。4、敲低miR-210表達抑制了缺氧狀態(tài)下腎癌細胞ACHN的增殖和侵襲能力,并且誘導細胞凋亡。目的:探討miR-210調(diào)控缺氧狀態(tài)下腎癌細胞ACHN的分子學機制
　　方法:通過生物信息學方法預測miR-210的靶基因,通過實時定量PCR及Western blot分別檢測常氧組、缺氧組和缺氧抑制組中的miR-210的表達量及靶基因的表達。
　　結(jié)果:選擇T

9、argetScan、PicTar、mirbase和miRanda這4個軟件對miR-210進行靶基因預測,VMP1、HOXA9、CBX7、FGFRL1和VAV3均為其可能的靶基因。運用實時定量PCR技術(shù),檢測轉(zhuǎn)染48h后常氧組,缺氧組和缺氧抑制組中miR-210的相對含量,結(jié)果顯示和腎癌細胞缺氧組相比,miR-210的相對含量在缺氧抑制組顯著下調(diào)。靶基因?qū)崟r定量PCR結(jié)果顯示VMP1的相對表達量在常氧組、缺氧組和缺氧抑制組ACHN細胞中

10、分別為3.3408±0.4391,1.3457±0.5235和2.2383±0.1785,三組相比有顯著性差異(P＜0.05);FGFRL1的相對表達量在三個組中分別為1.5235±0.7928,1.0996±0.3853和2.6076±0.4544;與缺氧組相比,缺氧抑制組中FGFRL1的相對表達量顯著性上調(diào)(P＜0.05);HOXA9、CBX7和VAV3在三個組中表達無顯著性差異。Western blot結(jié)果顯示HOXA9的蛋白表達

11、比值(HOXA9/GAPDH)在3個組分別為0.283±0.016,0.535±0.021和0.509±0.024,缺氧組與常氧組相比HOXA9的蛋白表達比值顯著性上調(diào)(P＜0.05),而缺氧組與缺氧抑制組相比無顯著性差異(P＞0.05);FGFRL1的蛋白表達比值(FGFRL1/GAPDH)在三個組中分別為0.208±0.01,0.151±0.01和0.471±0.11,缺氧組與常氧組相比FGFRL1的蛋白表達比值顯著性下調(diào)(P＜0.

12、05),缺氧抑制組與缺氧組相比FGFRL1的蛋白表達比值顯著性上調(diào)(P＜0.05)。VMP1、CBX7和VAV3在三個組中表達無顯著性差異。
　　結(jié)論:1、缺氧狀態(tài)下腎癌細胞中FGFRL1基因和蛋白表達與miR-210的表達呈負相關(guān)性;VMP1基因表達與miR-210的表達呈負相關(guān)而蛋白表達量與miR-210的表達無關(guān);HOXA9、CBX7、和VAV3基因、蛋白表達與之無明顯關(guān)系。2、FGFRL1為miR-210在缺氧狀態(tài)下腎癌細