Rspo1和β-catenin在羅非魚卵巢分化、維持過程中的功能研究.pdf

1、長(zhǎng)期以來，性別決定和性別分化在生殖生物學(xué)領(lǐng)域一直備受關(guān)注。曾經(jīng)有一段時(shí)間科學(xué)家認(rèn)為哺乳動(dòng)物中卵巢的發(fā)育是一個(gè)默認(rèn)和被動(dòng)的過程。但最近對(duì)哺乳類研究發(fā)現(xiàn)，雌性性別決定也是由Foxl2、R-spondin1(Rspo1)、Wnt4和β-catenin等轉(zhuǎn)錄因子嚴(yán)格控制之下的多基因參與的分子級(jí)聯(lián)。哺乳動(dòng)物性別決定是一個(gè)雄性的(Sry/Sox9/Fgf9)和雌性的(Rspo1/Wnt/β-catenin和Foxl2)信號(hào)通路的拮抗過程。表達(dá)數(shù)據(jù)暗

2、示Rspo1/Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能參與黒鯛、青鳉、斑馬魚、羅非魚等硬骨魚類的性腺分化。硬骨魚類同時(shí)存在兩個(gè)β-catenin（簡(jiǎn)寫為β-cat）基因，即β-cat1，β-cat2，并且它們編碼的氨基酸在N端以及中間的犰狳區(qū)域都很保守，而C端轉(zhuǎn)錄激活域差異較大，這種C端轉(zhuǎn)錄激活域的差異對(duì)β-cat轉(zhuǎn)錄激活靶基因能力有無影響，兩個(gè)β-cat在硬骨魚類性腺發(fā)育過程中又分別扮演什么角色都不清楚。為了更直接、更深入地研究Rspo

3、1/β-cat信號(hào)通路在硬骨魚類雌性性別分化過程中的作用，我們進(jìn)一步研究了羅非魚Rspo1、β-cat1和β-cat2基因在性別分化早期的表達(dá)模式，借助TopFlash熒光素酶報(bào)告體系研究Rspo1、β-cat1和β-cat2激活靶基因能力，最后通過TALEN基因組編輯技術(shù)，從基因缺失的角度深入研究Rspo1/β-cat信號(hào)通路的功能。同時(shí)，我們表達(dá)并純化出該信號(hào)通路抑制因子Dkk1的重組蛋白，并用純化的Dkk1和該信號(hào)通路的化學(xué)抑制劑

4、FH535分別離體孵育羅非魚卵巢，檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)變化。本研究是首次在硬骨魚類通過基因敲降的在體實(shí)驗(yàn)和離體孵育相結(jié)合的方式，直接證明該信號(hào)通路在雌性性別分化過程中的重要作用。具體結(jié)果如下：
　　1.鑒于硬骨魚類兩個(gè)β-cat氨基酸序列在C端轉(zhuǎn)錄激活域差異較大，我們分別將β-cat1缺失C端序列和β-cat2末端加入VP16激活域序列連入pcDNA3.1（β-cat1-C--pcDNA3.1，β-cat2-VP16-pcDNA3.1

5、），借助TopFlash熒光素酶報(bào)告體系，探討β-cat1和β-cat2激活靶基因的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-cat1可以激活TopFlash熒光素酶表達(dá)，而Rspo1和β-cat2不能。但Rspo1能夠增強(qiáng)β-cat1激活的TopFlash熒光素酶表達(dá)。β-cat2卻可以通過與β-cat1發(fā)生相互作用而增強(qiáng)β-cat1激活的TopFlash熒光素酶表達(dá)；β-cat2-VP16可以激活熒光素酶的表達(dá)，而β-cat1-C-轉(zhuǎn)錄激活能力大大降低。<

6、br>　　2.熒光定量PCR結(jié)果顯示Rspo1、β-cat1和β-cat2在卵巢中從孵化后20天開始上調(diào)，結(jié)合前期的原位雜交和免疫組化數(shù)據(jù)，我們推測(cè)Rspo1、β-cat1和β-cat2可能參與羅非魚雌性減數(shù)分裂過程。
　　3.通過TALEN基因組編輯技術(shù)敲降Rspo1。與對(duì)照組相比，Rspo1敲降XX羅非魚性腺在孵化后2個(gè)月發(fā)育延遲，生殖細(xì)胞停留在卵原細(xì)胞階段，無卵母細(xì)胞。同時(shí)免疫組化實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照相比，Rspo1敲降性腺中V

7、asa陽性細(xì)胞減少，但Rspo1敲降不影響雌激素合成酶Cyp19a1a在性腺體細(xì)胞表達(dá)；到孵化后6個(gè)月，Rspo1敲降個(gè)體性腺發(fā)育得到恢復(fù)，與對(duì)照相比卻可以檢測(cè)到雄激素合成酶Cyp11b2和雄性支持細(xì)胞標(biāo)記因子Dmrt1的表達(dá)，同時(shí)血清中雄激素（11-KT）水平顯著上調(diào)，而雌激素（E2）水平并沒有發(fā)生變化。
　　4.在孵化后60天，對(duì)照組卵巢中出現(xiàn)I、II時(shí)相卵母細(xì)胞，在β-cat1或β-cat2敲降60天的XX性腺，無I、II時(shí)

8、相卵母細(xì)胞的形成，生殖細(xì)胞停留在卵原細(xì)胞時(shí)期。免疫組化表明，與對(duì)照相比，在雌性個(gè)體敲降β-cat1或β-cat2不影響雌激素合成酶Cyp19a1a在性腺體細(xì)胞的表達(dá)；3月齡的β-cat1或2敲降雌魚出現(xiàn)I、II時(shí)相的卵母細(xì)胞，而性腺表現(xiàn)為雄性因子Dmrt1、Cyp11b2陽性，而對(duì)照卵巢檢測(cè)不到Dmrt1、Cyp11b2；到6月齡，β-cat1或2敲降雌魚卵巢發(fā)育趕上對(duì)照組，但此時(shí)的卵巢仍表現(xiàn)為 Cyp11b2陽性，同時(shí)血清中雄激素水平

9、比雌性對(duì)照高，但雌激素水平與對(duì)照沒差異。熒光定量PCR和Western blot結(jié)果表明，與對(duì)照比Foxl2、Dmrt1、Cyp11b2在β-cat1或2敲降雌魚性腺中上調(diào)，Cyp19a1a表達(dá)沒發(fā)生變化。
　　5.當(dāng)用30μg/ml Dkk1重組蛋白或者50μM化學(xué)抑制劑FH535孵育180天羅非魚卵巢4天后，均引起β-cat1和2表達(dá)下調(diào)，foxl2、dmrt1、cyp11b2表達(dá)上調(diào)，而 cyp19a1a表達(dá)沒發(fā)生變化。同時(shí)

10、，免疫組化顯示，6月齡羅非魚卵巢經(jīng)Rspo1/Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑FH535離體孵育4天后Cyp19a1a表達(dá)沒發(fā)生變化，F(xiàn)oxl2、Dmrt1和Cyp11b2表達(dá)上調(diào)。
　　綜上，在硬骨魚類中Rspo1可以激活β-cat1介導(dǎo)的信號(hào)通路，并在卵巢分化和維持中起重要作用；硬骨魚類中β-cat1和β-cat2通過協(xié)同作用發(fā)揮作用；這個(gè)信號(hào)通路在雌性個(gè)體中通過抑制雄性基因的表達(dá)和雄激素的合成而維持卵巢的雌性特征；盡