Gsdf和Wt1在羅非魚性別分化和性腺發(fā)育中的功能研究.pdf

1、許多養(yǎng)殖魚類生長具有明顯的性別二態(tài)性，性控育種技術是水產(chǎn)養(yǎng)殖增加產(chǎn)量和提高效率的有效途徑。尼羅羅非魚雄魚比雌魚生長快，全雄養(yǎng)殖還可避免過度繁殖，因此，單性化養(yǎng)殖是羅非魚行業(yè)標準。尼羅羅非魚是一種世界性的養(yǎng)殖魚類，性別受到單基因決定，具有XX/XY性別決定系統(tǒng)，人們提出遺傳全雄羅非魚（genetic male tilapia，GMT）技術控制性別，即采用YY超雄羅非魚與正常XX個體交配繁殖全雄XY魚，但是至今這個技術還沒有在水產(chǎn)養(yǎng)殖中推廣

2、，難點在于YY維持系的建立，YY雌魚誘導難度大，需要更高的雌激素處理濃度和更長的處理時間，即便獲得YY雌魚其育性也很低，本實驗室獲得的YY雌魚甚至不育，目前亟須圍繞這個問題開展羅非魚性別決定與分化的分子機制研究，為最終實現(xiàn)其遺傳性別控制的應用提供理論基礎和技術方法。gsdf是魚類特有的TGF-?家族成員基因，在魚類精巢高表達，最近在青鳉中的研究表明它在精巢分化中具有重要作用。Wt1在哺乳類參與雄性別決定與分化，而在魚類中的功能不是很清楚

3、。而魚類由于魚類特有的基因組的復制（3R）具有2個亞型：wt1a和wt1b。本研究通過CRISPR/Cas9建立了羅非魚gsdf和wt1敲除系，并對敲除系進行分析，研究gsdf和wt1在性別分化和性腺發(fā)育中的作用，并在ZX奧尼雜交雄性羅非魚（尼羅羅非魚XX♀×奧利亞羅非魚ZZ♂）中敲除gsdf研究其在魚類性別分化中功能是否保守，主要研究結果如下：
　　1、在本實驗室前期通過CRISPR/Cas9在尼羅羅非魚敲除gsdf獲得F0代陽

4、性魚的基礎上，采用F0代陽性魚開展gsdf基因純合敲除建系，分析了F0代XY嵌合體敲除率與性腺表型的關系，以及gsdf敲除的F1代雜合子和F2代純合子的表型。發(fā)現(xiàn)敲除率≧58％的XY性腺在90 dah（days after hatching，孵化后天數(shù)）時發(fā)育為卵精巢，在180和240 dah時完全逆轉為卵巢，敲除率<58%的XY性腺發(fā)育為正常精巢，F(xiàn)1代XYgsdf+/-性腺都發(fā)育為精巢，而F2代XY gsdf-/-性腺都發(fā)育為卵巢。

5、通過F1代XY gsdf+/-與F0代性逆轉的XY雌魚回交，獲得了YY gsdf-/-，60dah時通過組織學觀察顯示它們都發(fā)育為卵巢。說明gsdf是尼羅羅非魚雄性性別分化所必需的基因，且在雄性性別分化過程中Gsdf的需求有一定閾值。
　　2、免疫組化檢測純合突變性腺分化早期的基因表達發(fā)現(xiàn)：XY gsdf-/-性腺在10 dah雄性通路已經(jīng)開啟，表達Dmrt1，然后在18 dah，雌雄通路都開啟，同時表達Dmrt1和Cyp19a1

6、a，在孵化后36天，關閉了雄性通路，僅開啟雌性通路，只表達Cyp19a1a，并出現(xiàn)I時相的卵母細胞，完成了由雄向雌的性逆轉，表明在沒有Gsdf的情況下，XY性腺可開啟雄性信號通路，表達Dmrt1，但不能夠維持。通過對正常XY性腺鄰近切片免疫組化分析發(fā)現(xiàn)4 dah時Gsdf和Dmrt1均沒有表達，而在5 dah之后，Gsdf和Dmrt1共表達于性腺的支持細胞。對gsdf啟動子序列分析發(fā)現(xiàn)上面具有一個Dmrt1的結合位點。在HEK293細胞

7、中進行gsdf啟動子分析發(fā)現(xiàn)Dmrt1單獨轉染不能激活gsdf的轉錄，當與Sf1共轉染時Dmrt1能夠劑量依賴地增強Sf1激活的gsdf轉錄。這些結果表明在尼羅羅非魚雄性性別決定通路中gsdf是dmrt1的下游靶基因。
　　3、通過Real-time PCR檢測90dah gsdf-/-性腺基因表達，發(fā)現(xiàn)促進雌激素合成酶cyp19a1a表達的基因foxl2在XY gsdf-/-個體的表達水平顯著高于正常的XY gsdf+/+個體，

8、而與XX gsdf+/+和gsdf-/-個體差異不顯著，雄激素合成酶cyp11b2在 XY gsdf-/-個體的表達水平顯著低于正常的XY gsdf+/+個體，而與XX gsdf+/+和gsdf-/-個體差異不顯著，血清雌激素（E2，17β-estradiol）和雄激素（11-KT，11-ketotestosterone）水平檢測得到與此相一致的結果。通過芳香化酶抑制劑（aromatase inhibitor。AI）投喂處理XY gsd

9、f-/-個體，處理時間從10到35 dah，能夠回救敲除表型，性腺發(fā)育為精巢，表達Dmrt1和Cyp11b2，回救魚在180 dah能產(chǎn)生正常精子，并能夠正常授精。表明Gsdf可能通過下調雌激素的合成、上調雄激素的合成而促進精巢的分化，但其涉及的分子機制有待闡明。
　　4、引入奧利亞羅非魚培育建立純系和雜交系。將ZZ奧利亞雄魚與尼羅羅非魚XX雌魚交配，獲得了100%的ZX雄性羅非魚。將ZX雄魚與尼羅羅非魚XX回交，獲得了1:1的雌

10、雄性比。將ZW奧利亞雌魚與YY超雄尼羅羅非魚雜交，獲得了100%雄性后代。奧利亞ZZ雄魚與ZW雌魚交配，獲得了1:1的雌雄比后代。采用Fadrozole處理能將奧利亞ZW雌魚逆轉為正常雄魚，ZW雄魚與尼羅XX雌魚雜交，獲得1:1的雌雄性比后代。將ZW雄魚與ZW雌交配，可以獲得3:1的雌雄性比。結合尼羅非魚XX為雌魚，XY為雄魚，以及奧利亞非魚ZZ為雄魚，ZW為雌魚的事實，說明了在尼羅和奧利亞羅非魚性染色體的性別控制能力由強到弱為：Y>W

11、>Z>X。通過轉錄組測序分析獲得了奧利亞羅非魚的gsdf ORF序列，發(fā)現(xiàn)其與尼羅羅非魚序列相似度達到99.5%。通過免疫組化研究了Gsdf在ZX全雄雜交羅非魚性腺的10 dah表達，發(fā)現(xiàn)ZX性腺與XY性腺一樣高表達Gsdf。進一步在ZX魚CRISPR/Cas9敲除gsdf，近一半F0代陽性魚性逆轉為雌魚，證明了gsdf在不同遺傳背景下保守的促進雄性性別分化的功能。
　　5、通過原位雜交研究了wt1a和wt1b的表達。在腎臟中，w

12、t1a表達于3、5、20和40 dah腎小球中，而wt1b在3dah的腎小球中不表達，5、20和40 dah都表達于腎小球中。在早期性腺中，wt1a和wt1b都表達于3和5 dah的性腺體細胞中；在成魚卵巢中，wt1a表達于顆粒細胞、鞘膜細胞和間質細胞，wt1b表達于間質細胞；在成魚精巢中，wt1a表達于支持細胞，wt1b表達于間質細胞。通過CRISPR/Cas9敲除了wt1a和wt1b，并分別構建了純合敲除系。wt1a-/-在6 da

13、h時出現(xiàn)嚴重腹水，10 dah全部死亡，wt1b-/-不致死。進一步組織切片觀察發(fā)現(xiàn)6 dah時wt1a-/-個體的腎臟中未見腎小球形成，wt1b-/-和對照的腎小球發(fā)育正常。wt1a在腎小球早期單獨表達，可能對其發(fā)育至關重要，wt1b不能補償wt1a在腎臟早期發(fā)育中的功能。在180 dah對wt1b純合敲除的后代進行分析：組織學觀察發(fā)現(xiàn)XX wt1b-/-性腺發(fā)育為正常的卵巢，XY wt1b-/-性腺發(fā)育為正常的精巢；免疫組化分析顯示

14、wt1b-/-的XX性腺表達Cyp19a1a,不表達Cyp11b2，wt1b-/-的XY性腺,表達Cyp11b2，不表達Cyp191a；血清激素水平顯示，wt1b-/-的XX個體E2和11-KT與對照XX（wt1b+/+和wt1b+/-）雌魚差異不顯著；XY wt1b-/-個體E2和11-KT對照XY（wt1b+/+和wt1b+/-）雄魚差異不顯著。wt1b-/-的雄性個體在180 dah時能產(chǎn)生精子，并能夠正常授精。wt1a純合敲除致

15、死，其對性別決定的功能不得而知，而wt1b純合突變不會影響羅非魚存活和性別決定，wt1b在精巢發(fā)育中的功能冗余，在卵巢發(fā)育是否冗余需要進一步驗證。
　　綜上所述，gsdf純合敲除能夠導致XY和YY魚性別逆轉，證明是Gsdf在羅非魚雄性性別決定通路必需基因。也為建立羅非魚YY維持系提供了新的技術途徑。Dmrt1能在gsdf純合敲除后的XY性腺表達，gsdf啟動子具有Dmrt1結合位點，且啟動子分析發(fā)現(xiàn)Dmrt1在Sf1存在的情況下能

16、上調gsdf的轉錄，表明gsdf在羅非魚雄性性別通路中位于dmrt1的下游。gsdf可能是通過下調雌激素水平、上調雄激素水平來控制雄性性別的。與XY一樣，在ZX雜交魚中敲除gsdf同樣導致由雄向雌的性逆轉，證明Gsdf在具有不同遺傳背景的羅非魚雄性性別分化中功能保守。wt1a純合敲除致死說明wt1a對于羅非魚存活至關重要，且wt1b不能補償wt1a的功能。wt1a純合敲除致死，其對性別決定的功能不得而知，wt1b純合敲除不會影響羅非魚的