尼羅羅非魚Dmrt1、Amh和Cypllb2抗體制備及其在正常發(fā)育和性逆轉性腺中的表達研究.pdf

1、性別決定和性別分化是脊椎動物性腺發(fā)育的兩個關鍵事件，涉及多種轉錄因子、生長因子和性類固醇激素，如Dmrtl、Amh、雌激素等。同樣作為性類固醇激素的雄激素卻不參與性別決定，而是與精子發(fā)生有著密切的關系。Dmrt1(Doublesexandmab-3relatedtranscriptionfactor1)是DM家族成員之一，是迄今發(fā)現的從無脊椎動物到人最保守的與性別決定相關的基因，它所編碼的蛋白質包含一個具有DNA結合能力的保守基序，即D

2、M結構域。Amh(Anti-MüllerianHormone)是一種糖蛋白，屬于TGF-β超家族,誘導雄性哺乳動物繆勒氏管的退化。真骨魚類雖然沒有繆勒氏管，但仍然有Amh表達，那么，它在真骨魚類性別分化中發(fā)揮怎樣的作用，還有待研究。真骨魚類雄激素11-酮基睪酮(11-KT)合成所必需的關鍵酶是Cyp11b2(11β-hydroxylase)，它直接催化睪酮轉變?yōu)?1β-羥基睪酮，后者再由11β-HSD催化形成11-KT。真骨魚類雌激素合

3、成所必需的關鍵酶是Cyp19a1a(aromatase)，它直接催化睪酮形成雌二醇。Dmrt1、Amh和Cyp11b2在真骨魚類性腺發(fā)育中均有重要作用，在尼羅羅非魚也有相應研究，但因缺乏相應的抗體，導致其蛋白水平的研究幾乎無法開展。故本研究制備了尼羅羅非魚Dmrt1、Amh和Cyp11b2多克隆抗體，并對其在正常和性逆轉尼羅羅非魚性腺中蛋白水平的表達進行了初步研究。
　　 尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)具

4、有生長速度快、性成熟時間短、繁殖周期短等特點，因此，它是研究性別決定及分化的好材料。且本實驗室具有成熟的獲得尼羅羅非魚全雄、全雌魚苗及人工誘導其性逆轉（外源雌激素可誘導XY雄魚向雌魚逆轉，外源雌激素合成酶抑制劑可誘導XX雌魚向雄魚逆轉）技術，取材方便快捷，故本實驗選擇羅非魚作為實驗動物。
　　 本研究利用RT-PCR擴增出完整的Dmrt1、Amh和Cyp11b2ORF(openreadingframe)，將其連接進pColdⅠ表

5、達載體中進行原核表達，重組蛋白經過鎳柱親和純化并尿素梯度透析復性后免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體，利用CNBr激活的Sepharose4B對抗體進行親和純化，獲得Dmrt1、Amh和Cyp11b2多克隆抗體。之后，利用Westernblot檢測1年齡尼羅羅非魚性腺組織Dmrt1、Amh和Cyp11b2表達，免疫組化方法檢測其在尼羅羅非魚不同發(fā)育時期精巢和卵巢組織中表達情況，同時利用實驗室已有的Cyp19a1a抗體，檢測Dmrt1、Am

6、h、Cyp11b2和Cyp19a1a在性逆轉性腺中的表達情況。
　　 Westernblot檢測發(fā)現，Dmrt1多克隆抗體可以特異的識別Dmrt1重組蛋白，分子量約為35kD，同時，在精巢總蛋白識別單一條帶，而在卵巢并未檢測到條帶，證實Dmrt1抗體具有特異性，且Dmrt1在尼羅羅非魚只在精巢特異表達，而在卵巢組織幾乎不表達。免疫組化檢測發(fā)現，Dmrt1從性別決定關鍵時期5dah(dah，daysafterhatching)開始

7、高表達于XY精巢Sertoli前體細胞，在精巢發(fā)育后期表達于Sertoli細胞和輸精管上皮細胞。同期的XX卵巢中未見表達。而在外源雌激素E2(Estradiol)誘導XY性逆轉過程中，到10-15dah時Dmrt1表達量明顯降低，到70dah已完全檢測不到，Letrozole（雌激素合成關鍵酶Cyp19ala抑制劑）誘導XX性逆轉過程中，Dmrt1在15dah時開始表達，隨后表達量逐漸升高，到70dah時與XY對照組沒有差別。此結果暗示

8、，Dmrt1在尼羅羅非魚性別決定、精巢維持及性逆轉中發(fā)揮至關重要的作用。
　　 同時，檢測性逆轉尼羅羅非魚性腺中Cyp19a1a發(fā)現，E2誘導XY性逆轉過程中，Cyp19a1a在10dah時開始表達，隨后表達量逐漸上升，到60dah時與XX對照組沒有差別。Letrozole誘導XX性逆轉過程中，Cyp19a1a表達量逐漸減少并在60dah時消失。有趣的是，在E2和Letrozole處理10-15dah時，性腺組織同時表達Dmrt

9、1和Cyp19a1a。說明在性逆轉過程中，存在雌雄通路的對抗作用。
　　 Westernblot檢測Amh多克隆抗體發(fā)現，該抗體可特異識別出Amh重組蛋白，分子量約為54kD，且在精巢和卵巢組織同時檢測到單一條帶，證實Amh抗體具有特異性，且Amh在尼羅羅非魚精巢和卵巢組織均有表達。免疫組化檢測發(fā)現，Amh在5-180dah均高表達于卵巢顆粒細胞和鞘膜細胞，及精巢葉邊細胞和Sertoli細胞。免疫組化檢測性逆轉性腺發(fā)現，Amh在

10、Letrozole誘導XX魚性逆轉過程中表達量逐漸升高，而在E2誘導XY魚性逆轉過程中表達不明顯，直到70dah才檢測到微弱的信號。本研究推測Amh在精巢發(fā)育早期發(fā)揮重要作用，并參與精子發(fā)生和精子運輸過程，而在卵巢發(fā)育早期作用不明顯，待卵巢發(fā)育到一定時期才發(fā)揮作用。
　　 同樣的，Westernblot檢測發(fā)現Cyp11b2抗體可以特異識別出分子量約為64kD的目的條帶，即Cyp11b2重組蛋白，同時，該抗體在精巢組織總蛋白識別

11、出一條大約58kD的內源性條帶，而在卵巢并未檢測到條帶，這說明Cyp11b2抗體具有特異性，并且Cyp11b2在羅非魚只在精巢特異表達，而在卵巢組織不表達。免疫組化檢測發(fā)現，Cyp11b2特異表達于30dah以后的精巢Leydig細胞，而在性別決定關鍵時期5dah并不表達。Cyp11b2在Letrozole處理XX雌魚早期并不表達，在70dah時才檢測到信號。推測，Cyp11b2或者Cyp11b2催化合成的產物11-KT調節(jié)和維持精子發(fā)