中華鱉DMRT1基因在雄性性腺發(fā)育中的影響研究.pdf

1、中華鱉（Pelodiscus sinensis），俗稱甲魚(yú)，隸屬于爬行綱、龜鱉目、鱉科，是我國(guó)南方重要的名特優(yōu)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。養(yǎng)殖過(guò)程中，雄鱉比雌鱉生長(zhǎng)快25.0％～30.0%，且雄鱉裙邊寬厚，脂肪少，深受市場(chǎng)歡迎，同比單價(jià)雄鱉比雌鱉高25%。鑒于此，業(yè)內(nèi)圍繞中華鱉性別控制開(kāi)展了一系列的技術(shù)探索，但仍無(wú)法使雄鱉苗比例超過(guò)65%，這主要是因?yàn)橹腥A鱉性別決定分子機(jī)制的不清楚。
　　為了揭開(kāi)中華鱉性別決定分子機(jī)理的神秘面紗，本文以雄性性別

2、相關(guān)基因DMRT1（double sex and mab3 relatated transcription factor1）為切入點(diǎn)，以其cDNA全序列的克隆為基礎(chǔ)，研究DMRT1基因在不同組織和不同發(fā)育階段雌雄性腺中的表達(dá)情況、細(xì)胞定位以及在雌激素誘導(dǎo)的性逆轉(zhuǎn)中的表達(dá)變化。本研究旨在初步探索DMRT1基因在中華鱉性別決定中的調(diào)控作用，為后續(xù)DMRT1的功能研究、中華鱉單性育種及性別決定分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下：
　

3、?。?）通過(guò)RACE的方法獲得了DMRT1基因全長(zhǎng)cDNA序列，該序列為2409個(gè)堿基，其中開(kāi)放閱讀框（ORF）為1107個(gè)堿基，編碼368個(gè)氨基酸。cDNA全長(zhǎng)中還包含5′非編碼區(qū)的67個(gè)堿基，一個(gè)長(zhǎng)的3′非編碼區(qū)的1058個(gè)堿基，以及終止密碼子TAA和多聚A尾巴。根據(jù)NCBI網(wǎng)站的氨基酸序列BLAST分析，得到中華鱉與龜鱉類(lèi)同源性最近，尤其與西部錦龜相似度最高，其次與鱷類(lèi)動(dòng)物也有很近的親緣關(guān)系。另外對(duì)中華鱉心、肝、脾、肺、腎、肌、卵

4、及睪丸中DMRT1基因mRNA表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)DMRT1基因只在睪丸組織中大量表達(dá)，而其他組織不表達(dá)。這說(shuō)明中華鱉DMRT1基因呈現(xiàn)高度雄性特異性表達(dá)。
　　（2）為了研究DMRT1在中華鱉雄性性腺發(fā)育中的作用，本實(shí)驗(yàn)首先分析了DMRT1在不同發(fā)育時(shí)期性腺中的表達(dá)規(guī)律和細(xì)胞定位。免疫熒光染色結(jié)果顯示：在性腺分化之前的第16期雄性性腺中, DMRT1蛋白開(kāi)始表達(dá)，定位在體細(xì)胞核中，生殖細(xì)胞中未見(jiàn)表達(dá)。第17期時(shí)，雄性性腺中的DMRT1

5、蛋白表達(dá)量顯著增加，雌性性腺中未見(jiàn)表達(dá)。性腺發(fā)育至第19期時(shí)，性腺分化已經(jīng)開(kāi)始，DMRT1蛋白大量定位于雄性性腺Sertoli前體細(xì)胞細(xì)胞核中，圍繞原始生殖細(xì)胞。隨著胚胎進(jìn)一步發(fā)育，雄性性腺皮質(zhì)區(qū)進(jìn)一步退化形成單細(xì)胞層，髓質(zhì)區(qū)繼續(xù)發(fā)育形成性索，DMRT1蛋白大量表達(dá)，繼續(xù)定位在Sertoli前體細(xì)胞上。而雌性性腺皮質(zhì)進(jìn)一步發(fā)育，髓質(zhì)退化并出現(xiàn)空泡結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)DMRT1蛋白表達(dá)。出生后，中華鱉雄性性腺不斷發(fā)育形成睪丸，原始性索發(fā)育形成曲細(xì)精

6、管，由sertoli細(xì)胞圍繞形成，將各級(jí)生殖細(xì)胞包繞起來(lái)。在1-3齡中華鱉睪丸中，DMRT1蛋白繼續(xù)分布在曲細(xì)精管基部的sertoli細(xì)胞上，各級(jí)生殖細(xì)胞未見(jiàn)表達(dá)。在3齡中華鱉卵巢中，未見(jiàn)DMRT1蛋白表達(dá)?；?6-19期為中華鱉性別決定和性腺分化的關(guān)鍵時(shí)期，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DMRT1基因極可能在中華鱉早期雄性性別分化中扮演調(diào)控角色。
　?。?）在大部分脊椎動(dòng)物中，雌激素在性別決定和性腺分化中扮演重要的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)性

7、別分化前胚胎進(jìn)行雌二醇（E2）和芳香化酶抑制劑（AI）處理，研究雌激素在中華鱉性腺分化中的作用及機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組（雌性比例49%）相比，E2處理組中雌性中華鱉仔鱉比例顯著增加，高達(dá)92.3%；而在AI處理組中，雌性比例顯著下調(diào)至13.1%。雄性ZZ胚胎經(jīng)過(guò)E2處理后，性腺結(jié)構(gòu)明顯雌性化，雄性特異性基因SOX9mRNA表達(dá)顯著下調(diào)；雌性ZW胚胎經(jīng)過(guò)AI處理后，性腺結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)雄性化特征，雄性特異性基因SOX9表達(dá)顯著上升，說(shuō)明雌激

8、素在中華鱉雌性性別分化中起著重要的調(diào)控作用?；诖诵约に卣T導(dǎo)的性逆轉(zhuǎn)模型的建立，本文還分析了DMRT1基因在性逆轉(zhuǎn)中的表達(dá)變化。RT-PCR和免疫熒光染色結(jié)果顯示：在E2誘導(dǎo)的雄性向雌性性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中，DMRT1基因表達(dá)顯著下降；AI誘導(dǎo)的雌性向雄性性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中，DMRT1基因則被誘導(dǎo)表達(dá)。以上結(jié)果表明，DMRT1參與中華鱉雄性性別分化過(guò)程。
　　本文研究結(jié)果表明DMRT1基因?yàn)橹腥A鱉雄性特異性基因，參與雄性性腺分化過(guò)程，為后續(xù)DM