Sry基因沉默對(duì)小鼠胚胎性別決定基因及性腺發(fā)育的影響.pdf

1、SRY(sex-determiningregionoftheYchromosome，鼠上稱Sry)是Y染色體上的性別決定基因，是激發(fā)哺乳動(dòng)物兩性潛能的性腺向雄性分化的開關(guān)基因。雄性性別分化的過程是以SRY基因?yàn)橹鲗?dǎo)的一系列上游基因和下游基因參與的級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程。由于SRY基因的體內(nèi)研究難于操作致使SRY基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究進(jìn)展緩慢，至今為止。SRY的下游作用靶基因還沒有鑒定出來。為進(jìn)一步研究SRY基因功能，本研究采用siRNA表達(dá)載體介導(dǎo)的

2、RNAi技術(shù)，特異性地抑制睪丸決定因子Sry在小鼠胚胎中的表達(dá)。觀察Sry基因沉默后對(duì)在兩性性腺分化中起重要作用的WT1(Wilms’tumorgene)、Sox9(Sry-relatedHMGbox-9)，SF1(Steroidogenicfator-1)，GATA4(GATAbindingprotein4)、AMH(AntiMullerianHormone)和DAX1(Dosagesensitivesexreversallocus-

3、1)基因表達(dá)的影響，以及對(duì)小鼠胚胎性腺組織發(fā)育的影響。進(jìn)一步揭示了Sry基因的調(diào)控機(jī)制，并為研究附植后小鼠胚胎發(fā)育基因提供了新思路。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下： 1)Sry小干擾RNA表達(dá)載體的重構(gòu)，及其在胚胎中的表達(dá)鑒定。在本課題組先前構(gòu)建的siRNA重組表達(dá)載體(pSilencer4.1/Sry565)和對(duì)照載體(pSilencer4.1-CMVneo)上分別插入EGFP表達(dá)框，即重構(gòu)為含有綠色熒光蛋白的Sry干擾載體pSil

4、encer4.1/Sry565-EGFP(簡(jiǎn)稱為pSry565-EGFP)和對(duì)照載體pSilencer4.1-CMVEGFPvector(簡(jiǎn)稱為pControl-EGFP)。應(yīng)用尾靜脈注射法將siRNA表達(dá)載體和對(duì)照載體分別導(dǎo)入妊娠9.5天(9.5dpc)的母鼠體內(nèi)，在11.5dpe時(shí)取胚胎，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白在小鼠胚胎中全身表達(dá)。證明，應(yīng)用尾靜脈大量注射法可以將干擾質(zhì)粒通過孕鼠導(dǎo)入小鼠胚胎，且干擾質(zhì)粒在胚胎中廣泛表達(dá)無明

5、顯組織特異性。 2)siRNA表達(dá)載體對(duì)Sty基因抑制效果檢測(cè)。在11.5dpc時(shí)取胚胎，對(duì)胚胎進(jìn)行性別鑒定。性別鑒定為雄性的胚胎以RT-PCR法檢測(cè)SrymRNA的表達(dá)抑制效果，用Western-blot檢測(cè)SRY蛋白表達(dá)抑制效果。結(jié)果表明，pSry565-EGFP的抑制效果顯著，Sty基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低，對(duì)StymRNA和SRY蛋白的抑制率可達(dá)80％。 3)Sry基因抑制對(duì)WT1，SF1，DAX1

6、，GATA4，Sox9及AMH基因表達(dá)的影響。用RT-PCR法檢測(cè)WT1等上述性別決定相關(guān)基因表達(dá)變化情況。結(jié)果表明，Sry基因沉默后，WT1基因表達(dá)量升高；而被認(rèn)為最有可能是Sry下游基因的Sox9基因的表達(dá)沒有明顯變化；GATA4，SF1，DAX1基因表達(dá)水平也沒有顯著變化；在Sty基因表達(dá)抑制的小鼠胚胎和陰性對(duì)照的胚胎中均未檢測(cè)到AMH基因表達(dá)。結(jié)論，Sry基因表達(dá)抑制會(huì)導(dǎo)致WT1基因表達(dá)升高；另外，Sry基因激活Sox9基因的表