水牛SRY基因及胚胎性別鑒定技術(shù)的研究.pdf

1、本論文研究?jī)?nèi)容是水牛SRY基因和胚胎性別鑒定PCR體系的建立和優(yōu)化。論文共分為兩部分：第一部分，包括第一章和第二章，為文獻(xiàn)綜述部分；第二部分，包括第三章和第四章，為試驗(yàn)研究部分。 第三章研究目的是通過(guò)對(duì)水牛SRY基因的克隆、序列分析及Southern雜交檢測(cè)，為進(jìn)一步研究SRY基因的作用機(jī)理和設(shè)計(jì)特異于水牛SRY基因的胚胎性別鑒定引物打下基礎(chǔ)。根據(jù)荷斯坦牛SRY基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，PCR擴(kuò)增后得到水牛SRY基因，測(cè)序后分析表明，該

2、基因長(zhǎng)度為2005bp，其中1～504bp為5’啟動(dòng)子區(qū)(Promoter)，1196～2005bp為3’側(cè)翼序列(UTR)，505～1195bp為SRY的讀碼框(ORF)。將該基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(登錄號(hào)為DQ417872)。BLAST比對(duì)顯示，與牛屬動(dòng)物的同源性為95﹪～96﹪，其中HMG-box區(qū)的同源性高達(dá)99﹪，具有高度的進(jìn)化保守性。使用ClustalX對(duì)水牛SRY基因外顯子區(qū)域做多重比對(duì)分析后，構(gòu)建部分哺乳動(dòng)物

3、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，與實(shí)際進(jìn)化關(guān)系保持很好的一致。在SRY基因保守區(qū)設(shè)計(jì)探針，分別對(duì)雄性水牛和雌性水?；蚪M進(jìn)行Southern雜交，只在雄性水牛出現(xiàn)雜交信號(hào)，說(shuō)明SRY基因?yàn)樾坌蕴禺悺?第四章研究目的是建立并優(yōu)化水牛胚胎性別鑒定的PCR體系，以便該項(xiàng)技術(shù)能在生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用。根據(jù)第三章中水牛SRY基因核心序列設(shè)計(jì)兩對(duì)特異于水牛的性別鑒定引物SA1/SA2、SB1/SB2，根據(jù)小鼠ZFX/ZFY基因和水牛G3PDH基因分別設(shè)計(jì)內(nèi)參引物Z

4、A1/ZA2、GA1/GA2。對(duì)不同哺乳動(dòng)物的DNA進(jìn)行特異性檢測(cè)和梯度濃度的公水牛DNA進(jìn)行敏感性檢測(cè)以篩選出最佳引物。分別使用煮沸法、蛋白酶K+Tween20法、Tween20+DTT法裂解胚胎樣品，擴(kuò)增雌雄共有的G3PDH基因，比較擴(kuò)增結(jié)果篩選出最佳的胚胎裂解方法。結(jié)果顯示，1)引物SB1/SB2、GA1/GA2擴(kuò)增結(jié)果較好，分別作為檢測(cè)引物和內(nèi)參引物；2)三種處理方法的有效檢出率分別為85.3﹪(29/34)、97.1﹪(33/

5、34)和97.1﹪(33/34)，后兩種處理方法的擴(kuò)增效率高于煮沸法，為簡(jiǎn)化操作，選取DTT+Tween20法。 對(duì)篩選出的引物SB1/SB2和GA1/GA2設(shè)計(jì)一對(duì)巢式引物SB3/SB4、GA3/GA4，建立多重巢式PCR體系，對(duì)不同Mg2+濃度、不同dNTPs濃度、不同引物濃度比例和不同循環(huán)數(shù)進(jìn)行多次試驗(yàn)以優(yōu)化多重巢式PCR反應(yīng)體系。采用以上優(yōu)化后PCR反應(yīng)體系，對(duì)27枚水牛桑椹胚和24枚Y精子受精的IVF胚胎進(jìn)行性別鑒定，

6、并使用斑點(diǎn)雜交方法驗(yàn)證PCR擴(kuò)增準(zhǔn)確率，結(jié)果顯示，1)多重巢式PCR體系中，Mg2+濃度為1.5mM，dNTPs濃度為100μM；引物SB3/SB4、GB3/GB4濃度分別為0.5μM、0.25μM時(shí)擴(kuò)增效果較好，循環(huán)數(shù)以35為宜；2)27枚水牛桑椹胚可鑒定率為100﹪，雄性比例為51.9﹪(14/27)，雌性比例為48.1﹪(13/27)。斑點(diǎn)雜交結(jié)果表明擴(kuò)增準(zhǔn)確率為100﹪；3)Y精子受精胚胎鑒定結(jié)果中雄性比例為83.3﹪(20/2