重組人鈣調(diào)素對(duì)小鼠胚胎體外發(fā)育及凋亡影響的研究.pdf

1、本研究分為二部分：第一部分、重組人鈣調(diào)素對(duì)小鼠早期胚胎體外發(fā)育的影響。
　　 目的：研究小鼠胚胎在添加重組人鈣調(diào)素(recombinant human calmodulin rhCaM)的培養(yǎng)基中的發(fā)育情況，探討外源重組人鈣調(diào)素對(duì)小鼠早期胚胎體外發(fā)育的影響。
　　 方法：配制CZB培養(yǎng)液，CZB-Hepes(CZB-H)操作液。8-10周齡昆明系雌性小鼠相隔48小時(shí)先后腹腔注射PMSG和HCG，后與同種雄鼠2：1立即合籠

2、過夜。次日晨發(fā)現(xiàn)有陰栓者即判定為妊娠第一天。將妊娠雌鼠于注射HCG 40小時(shí)后頸椎脫臼處死，剪下輸卵管置于預(yù)溫（37℃）的CZB-H中，挑破輸卵管取2-細(xì)胞期胚胎，每15-20枚放入rhCAM終濃度分別為0（對(duì)照組）,0.2ug/ml,2.0ug/ml,20ug/ml,200ug/ml的25ul的微滴培養(yǎng)液中。觀察并記錄胚胎發(fā)育情況，HCG 注射120小時(shí)后將擴(kuò)張囊胚和孵化囊胚行Hoechst33342染色，熒光顯微鏡下囊胚細(xì)胞計(jì)數(shù)。<

3、br>　　 結(jié)果：HCG注射120小時(shí)后，20ug/ml rhCaM濃度組囊胚率，擴(kuò)張囊胚率和孵化囊胚率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，HCG注射后64小時(shí)胚胎發(fā)育成4-8細(xì)胞期胚胎形成率和88小時(shí)桑椹胚形成率：0.2ug/ml，2.0ug/ml，20ug/mlrhCaM組均高于對(duì)照組(p<0.05），200ug/mlrhCaM低于對(duì)照組(p<0.05)，200ug/ml rhCaM濃度組囊胚率，擴(kuò)張囊胚率和孵化囊胚率顯著低于其它各

4、組(P<0.05)。各組囊胚細(xì)胞計(jì)數(shù)無顯著差異（P>0.05）。
　　 結(jié)論：一定濃度外源鈣調(diào)素可促進(jìn)小鼠早期胚胎體外發(fā)育，但高濃度鈣調(diào)素抑制胚胎發(fā)育。
　　 第二部分、重組人鈣調(diào)素對(duì)小鼠胚胎體外發(fā)育及凋亡的影響。
　　 目的：探討外源重組人鈣調(diào)素對(duì)小鼠早期胚胎體外發(fā)育及凋亡的影響。
　　 方法：8-10周齡昆明系雌性小鼠相隔48小時(shí)先后腹腔注射PMSG和HCG，后與同種雄鼠2：1立即合籠過夜。次日晨發(fā)現(xiàn)

5、有陰栓者即判定為妊娠第一天。妊娠雌鼠于注射HCG 48小時(shí)后頸椎脫臼處死，收集2-細(xì)胞期胚胎放入rhCaM終濃度分別為0（對(duì)照組）,0.2μg/ml,2.0μg/ml,20μg/ml,200μg/ml的IVF-30微滴培養(yǎng)液中，每24小時(shí)觀察并記錄胚胎形態(tài)。體外培養(yǎng)72小時(shí)，發(fā)育至囊胚期的胚胎行TUNEL檢測(cè)。落射熒光顯微鏡下TUNEL染色陽性細(xì)胞在激發(fā)光波長(zhǎng)488nm下呈綠色，囊胚每個(gè)細(xì)胞DNA均被Hoechst33342染色，在UV

6、330nm-380nm激發(fā)光下呈藍(lán)色，據(jù)此可對(duì)每個(gè)囊胚進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。在激光共聚焦顯微鏡掃描觀察胚胎細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果：20μg/mlrhCaM濃度組的胚胎體外培養(yǎng)48小時(shí)的囊胚形成率，培養(yǎng)72小時(shí)的囊胚形成率和孵化囊胚率均高于對(duì)照組（P<0.05），該組體外培養(yǎng)72小時(shí)的囊胚平均凋亡細(xì)胞數(shù)和囊胚細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。200μg/mlrhCaM濃度組的胚胎囊胚形成率和孵化囊胚率均低于對(duì)照組（P<0.0