小鼠胚胎干細(xì)胞Notch1基因沉默對(duì)Dvl-1和JNK-3表達(dá)的影響.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)是一種高度未分化細(xì)胞，它具有發(fā)育的全能性，能分化出成體動(dòng)物的所有組織和器官。ESCs研究的科學(xué)價(jià)值在于這種能夠自我更新具有多分化潛能的干細(xì)胞，在胚胎發(fā)育、移植治療、基因治療以及新藥開(kāi)發(fā)等方面都有著廣闊的應(yīng)用前景，利用干細(xì)胞技術(shù)來(lái)治療疾病將是未來(lái)醫(yī)學(xué)的發(fā)展方向。 Notch1基因在許多組織細(xì)胞中表達(dá)，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺、造血細(xì)胞等，它編碼一種跨膜受體蛋白，參與調(diào)

2、節(jié)各種各樣細(xì)胞分化及發(fā)育的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并影響了多種生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。在ESCs中存在一種“旁側(cè)抑制”即位于ESCs表面的Notch1可與鄰近細(xì)胞表面的配體Delta結(jié)合，抑制其下游bHLH(basichelix-loop-helix)家族神經(jīng)分化基因如Mashl、NeuroD等的轉(zhuǎn)錄，從而抑制ESCs向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。因此，當(dāng)Notch1下調(diào)后，可以使ESCs從“旁側(cè)抑制”中釋放出來(lái)，進(jìn)而促進(jìn)ESCs向神經(jīng)細(xì)胞分化。 鑒于上述，本

3、實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建特異性Notch1的小干擾RNA(small interferingRNA，siRNA)真核表達(dá)載體抑制小鼠ESCs中Notch1基因的表達(dá)，并檢測(cè)dishevelled(Dvl)-1和c-jun terminal kinase(JNK)-3基因的mRNA表達(dá)變化，試圖從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分析Notch1表達(dá)受到抑制后對(duì)ESCs功能的影響。 方法： 1．構(gòu)建Notch1基因的siRNA真核表達(dá)載體：根據(jù)GenB

4、ank提供的Notch1基因的核苷酸序列，按照Ambion公司網(wǎng)站的siRNA設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)兩對(duì)雙鏈siRNA，先克隆入T載體，經(jīng)篩選，鑒定，測(cè)序后，雙酶切靶基因，再亞克隆入siRNA載體pSINsi-U6中構(gòu)建重組體pSINsi-U6-1和pSINsi-U6-2，篩選，并用限制性內(nèi)切酶酶切進(jìn)行鑒定。 2．通過(guò)脂質(zhì)體Lipofectamine 2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠ESCs 48小時(shí)，同時(shí)在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上，利用該載體帶有新霉素抗性篩選系統(tǒng)

5、，用G418篩選出陽(yáng)性克隆，并用Real-Time PCR技術(shù)檢測(cè)Notchl，Dvl-1和JNK-3 mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： 1．構(gòu)建了小鼠Notchl基因siRNA真核表達(dá)載體pSINsi-U6-1和pSINsi-U6-2，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測(cè)序證實(shí)與設(shè)計(jì)完全一致。 2．重組載體，空載體通過(guò)脂質(zhì)體Lipofectamine 2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠ESCs 48小時(shí)，Real-Time PCR檢測(cè)

6、Notchl mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示：未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組Notchl mRNA的表達(dá)均無(wú)明顯變化，而重組載體pSINsi-U6-1和pSINsi-U6-2兩組Notchl mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)。 3．pSINsi-U6-1的RNA干擾效果較pSINsi-U6-2強(qiáng)。 4．轉(zhuǎn)染后，用Real-Time PCR檢測(cè)了Dvl-1和JNK-3 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示：Dvl．1和JNK-3 mRNA的表達(dá)均上調(diào)。