小鼠和山羊胚胎干細(xì)胞的分離與培養(yǎng).pdf

1、近年來，胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ESCs)以其所具有的全能性、多能性、可操作性及可塑性等諸多優(yōu)點(diǎn)，成為醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題之一。小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)已在發(fā)育生物學(xué)、人類疾病和藥物開發(fā)等研究領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，小鼠ESCs建系技術(shù)的豐富完善為建立人類和動物ESCs系提供了參照標(biāo)準(zhǔn)和理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)以12.5～13.5d ICR小鼠胎兒制備小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)層，比較了甘油和DM

2、SO分別作為冷凍保護(hù)劑對MEF冷凍效果的影響；以3.5dICR小鼠胚胎為實(shí)驗(yàn)材料，探討了胚胎不同發(fā)育階段、血清、生長因子及傳代方法對ICR小鼠ES細(xì)胞分離培養(yǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1.在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞冷凍時，采用含10％甘油的DMEM溶液作為常規(guī)冷凍保護(hù)液效果好于含10％DMSO的DMEM溶液，細(xì)胞活力分別為0.787，0.728。
　　 2.3.5d的ICR小鼠胚胎大多為囊胚或桑椹胚，接種到MEF飼養(yǎng)層后，

3、以含15％FBS的ES細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，囊胚的貼壁率與ICM增殖率(75.4％，72.8％)均顯著高于桑椹胚(57.9％，52.6％)(P＜0.05)，且桑椹胚的貼壁及增殖速度都比囊胚緩慢，因此以囊胚進(jìn)行ICM的分離培養(yǎng)效果更佳。
　　 3.以ICR小鼠囊胚為材料，采用含15％FBS的ES細(xì)胞培養(yǎng)液的囊胚貼壁率及ICM增殖率(79.3％，69％)均比含15％KSR、5％FBS+10％KSR的細(xì)胞培養(yǎng)液高(42.9％，28.6％;7

4、5％，54.2％)，即培養(yǎng)液中添加15％FBS更有利于囊胚貼壁與ICM增殖，添加5％FBS+10％KSR更能滿足小鼠ES細(xì)胞在傳代培養(yǎng)過程中的生長需要，小鼠ES集落最高傳至6代。
　　 4.在對培養(yǎng)液中添加的因子進(jìn)行比較時，與無因子的對照組相比，培養(yǎng)液中添加因子對囊胚貼壁、ICM增殖及傳代均起到積極作用。添加10ng/mL LIF+10ng/mL SCF的效果比單獨(dú)添加一種因子的效果好，小鼠ES細(xì)胞最高傳至6代，高于單獨(dú)添加一種

5、因子的傳代數(shù)(4代，2代)。
　　 5.用含15％FBS的ES細(xì)胞培養(yǎng)液分離獲得的小鼠ICM分別采用3種傳代方法進(jìn)行傳代，傳代時采用5％FBS+10％KSR的ESCs培養(yǎng)液。采用差異貼壁法傳代效果最佳，最高傳至8代，酶消化法傳至4代，機(jī)械加酶消化法傳至6代。
　　 6.實(shí)驗(yàn)獲得了具有典型ES集落形態(tài)的ICR小鼠ES細(xì)胞，經(jīng)AKP染色呈陽性。
　　 7.本實(shí)驗(yàn)對ICR小鼠ES細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)獲得了類胚體，在體外培養(yǎng)

6、過程中小鼠ES細(xì)胞自發(fā)分化為成纖維樣細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞、脂肪樣細(xì)胞及神經(jīng)樣細(xì)胞等，并出現(xiàn)空泡化。
　　 目前，關(guān)于人及小鼠ESCs建系的研究已有詳細(xì)的報道，但家畜ESCs的研究依然處于初級階段，很少有關(guān)于家畜ESCs建系的報道。山羊胚胎干細(xì)胞(ESCs)和胚胎生殖細(xì)胞(EGCs)是生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物、克隆動物，制備乳腺生物反應(yīng)器等的理想候選細(xì)胞，然而至今仍沒有成功建系的報道。本實(shí)驗(yàn)以30～50d的山羊胎兒及6～8d的山羊囊胚為實(shí)驗(yàn)材料

7、，比較了飼養(yǎng)層及生長因子對分離培養(yǎng)山羊ES細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1.實(shí)驗(yàn)以機(jī)械法分離獲得的山羊ICM為材料，對比了MEF、GEF兩種飼養(yǎng)層及兩種含不同因子的培養(yǎng)液對山羊ES細(xì)胞的影響，結(jié)果表明采用MEF飼養(yǎng)層ICM增殖率優(yōu)于GEF飼養(yǎng)層；與對照組相比，培養(yǎng)液中添加LIF及SCF或胰島素對山羊ICM的貼壁、增殖及傳代都有積極影響；以MEF為飼養(yǎng)層，培養(yǎng)液中同時添加LIF和SCF時，培養(yǎng)山羊ES細(xì)胞的效果最佳，傳至3代。