山羊胚胎干細(xì)胞的分離與克隆.pdf

1、山羊胚胎干細(xì)胞的分離與克隆摘要本研究以山羊為材料，對影響山羊ES細(xì)胞、EG細(xì)胞分離與克隆的影響因素進(jìn)行了探討。為進(jìn)一步建立山羊ESEG細(xì)胞系奠定了基礎(chǔ)。實驗主要結(jié)果如下:1.收集妊娠2055d山羊胎兒50例，使用DMEM(高糖)15%NBS(或FBS)10ngmL0.1nunoVmL口一疏基乙醇2mmolmL谷氨酞胺0.01mmolmL非必需氨基酸十100IUmL青霉素十100IUml鏈霉素培養(yǎng)液從生殖靖游)中分離克隆山羊EG細(xì)胞，43

2、例出現(xiàn)EG樣細(xì)胞集落，最高一例傳至6代。胎齡為3036d山羊胎兒最適合山羊EG細(xì)胞分離與克隆，胎齡大于42d，很難得到山羊EG細(xì)胞。從新生關(guān)中奶山羊翠丸中分離培養(yǎng)出山羊皋丸支持細(xì)胞。對比分離得到的PGCs在飼養(yǎng)層GSCsMEFGEF上的生長效果，發(fā)現(xiàn)GSCsMEFGEF。在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加10%(1000IUml)LIF更有利于山羊EG的克隆。2用全胚法從192枚關(guān)山羊胚胎中分離得到82枚增殖lcm，接種在MEF或GEF飼養(yǎng)層上，使用D

3、MEM(高糖)十15%FBS0.1mMp琉基乙醇0.01mm非必需氨基酸10ngmlLIF十100IUmL青霉素100IUml鏈霉素培養(yǎng)液，用中濃度消化液(0.125%Trypsin0.02%EDTA)消化效果好，有一枚胚胎傳至第8代。3.MEFGEF在山羊胚胎貼壁率無顯著差異(P0.05)MEF和GEF飼養(yǎng)層均能促進(jìn)山羊ES細(xì)胞體外增殖。隨著胚齡的增加，胚胎的貼壁率和ICM的增殖率增加。孵化囊胚的貼壁率和增殖率最高，達(dá)90%和60，與

4、桑49胚相比，差異均顯著〔P0.05)添加LIF10nglml)有利于山羊ES細(xì)胞(P0.05)的分離與克隆。4.山羊ES細(xì)胞對胰酶不是很敏感，0.125%Trypsin0.02%EDTA是較好的ES細(xì)胞消化液，對細(xì)胞綜合損傷力小，且傳代后ES細(xì)胞集落形成能力也較高。6.分離得到的山羊ES細(xì)胞、EG細(xì)胞，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、AKP染色、SSEA.OCT4染色、體外分化實驗等，證明其具有胚胎干細(xì)胞的諸多特性。關(guān)鍵詞:關(guān)中奶山羊，胚胎干細(xì)胞，胚胎