半滑舌鰨基因組編輯 TALEN 技術(shù)的建立及雄性決定基因dmrt1的功能分析.pdf

1、一、半滑舌鰨基因組編輯TALEN技術(shù)的建立
　　基因組編輯技術(shù)對于海洋動物基因功能分析和基因工程育種具有重大意義和應用價值，開展海水養(yǎng)殖動物基因組編輯技術(shù)的研究，對于培育定點突變的海水養(yǎng)殖動物新品種至關(guān)重要。但由于海水養(yǎng)殖魚類胚胎顯微注射技術(shù)難度大，至今少有成功的報道，加之海水魚類仔魚數(shù)量過少、難以培育成活等問題，嚴重阻礙了海水魚類基因組編輯技術(shù)的研究進程，迄今國內(nèi)外未見有關(guān)海水養(yǎng)殖魚類基因組編輯的成功報道。本研究成功建立了海水鲆

2、鰈魚類半滑舌鰨胚胎顯微注射技術(shù)及基因組編輯技術(shù)，并在性別決定基因功能驗證上取得突破性進展。將GFP質(zhì)粒成功顯微注射到半滑舌鰨胚胎中并表達；利用TALEN技術(shù)成功敲除了半滑舌鰨Z染色體上的dmrt1基因，并獲得了33尾基因突變魚。
　　二、半滑舌鰨dmrt1基因在性別決定及性腺發(fā)育過程中的功能
　　本研究通過靶向dmrt1基因的TALEN mRNA顯微注射到半滑舌鰨胚胎中，成功誘導dmrt1基因的突變，突變效率最高達100％。

3、ZZ型dmrt1突變魚發(fā)育成中間有一個腔的卵巢樣精巢，精子發(fā)生被阻斷。Dmrt1突變雄魚的性腺中雌性性別相關(guān)基因foxl2和cyp19a1a顯著性增加。Dmrt1突變雄魚比正常雄魚生長快，與正常雌魚長勢一樣。同時，檢測到1尾雌雄同體魚，該魚的遺傳性別為ZW型，其上側(cè)性腺外形上像精巢，下側(cè)性腺外形上像卵巢。上下側(cè)性腺切片染色結(jié)果顯示，上側(cè)性腺呈現(xiàn)典型的精巢結(jié)構(gòu)，而下側(cè)性腺則呈現(xiàn)卵巢樣結(jié)構(gòu)。采用PCR分析了雌雄同體魚性腺的dmrt1基因突變

4、情況，在上側(cè)的精巢中未檢測到的dmrt1基因的突變，而在下側(cè)的卵巢樣性腺中則檢測到dmrt1基因的許多突變。由此表明dmrt1基因是半滑舌鰨雄性精巢發(fā)育必不可少的基因，是半滑舌鰨的雄性決定基因，并且是關(guān)聯(lián)著生長二態(tài)性。
　　三、半滑舌鰨雄性性別決定基因dmrt1突變家系的建立
　　通過基因組編輯技術(shù)敲除了半滑舌鰨dmrt1基因，將dmrt1基因定點突變魚培育至性成熟。然后分別在2015年和2016年通過人工繁育技術(shù)將篩選出的