半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）雌魚fosmid基因組文庫的構(gòu)建及初步分析.pdf

1、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)是我國優(yōu)質(zhì)的大型經(jīng)濟(jì)魚類，其養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，但目前基因組研究較少，限制了許多研究工作的深入開展。本研究構(gòu)建了第一個半滑舌鰨雌魚fosmid基因組文庫，對文庫的部分克隆進(jìn)行了雙末端測序和序列分析，并從中篩選了部分微衛(wèi)星多態(tài)性位點和一個性別相關(guān)序列。 主要結(jié)果如下： 1.半滑舌鰨雌魚fosmid基因組文庫的構(gòu)建和鑒定本研究用流式細(xì)胞術(shù)測得半滑舌鰨雌性基因組大小約為606.

2、36 Mb；從半滑舌鰨雌魚肌肉提取基因組DNA，選取大小合適的DNA片段，經(jīng)末端修復(fù)并回收后，再以fosmid質(zhì)粒作為載體，構(gòu)建了半滑舌鰨雌魚基因組文庫。該文庫含有49，920個克隆，重組率為96.88％；插入片段長度分布在33～45kb之間，平均為39.2kb，覆蓋率為雌性半滑舌鰨基因組的3.23倍，從文庫中篩選得到單拷貝DNA序列的概率為95.6％；對培養(yǎng)第一天和第六天的文庫克隆進(jìn)行比較檢測結(jié)果表明，文庫穩(wěn)定性高，培養(yǎng)過程中沒有發(fā)生

3、變化。半滑舌鰨fosmid基因組文庫的構(gòu)建，為該物種基因組的研究工作奠定了基礎(chǔ)，為開展測序、分子標(biāo)記發(fā)掘、功能基因篩選與定位、物理圖譜構(gòu)建等研究工作提供了有效的工具。 2.半滑舌鰨雌魚fosmid末端序列分析本研究從半滑舌鰨雌魚fosmid文庫中隨機(jī)選取1，152個克隆進(jìn)行雙末端測序，去除了大腸桿菌和載體的污染后獲得 2，247條序列。序列總長1，921，341bp，大約占半滑舌鰨雌魚基因組的3.170‰，A+T含量為57.9％

4、，G+C含量為42.1％。對這些序列進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果表明在2，247條序列中，有848條序列與數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有的序列有明顯的相似性(E

5、有232條，其中的32條序列與三刺魚的EST相似，31條與青鳉Oryzias latipes EST相似。BLASTX比對有明顯相似性的序列有384條，占序列總數(shù)的17.09％，其有144條序列與青黑斑河豚Tetraodon nigroviridis相似，106條與斑馬魚Danio rerio相似。 3.從半滑舌鰨雌魚fosmid文庫中篩選微衛(wèi)星標(biāo)記本研究使用軟件TANDEM REPEATS FINDER(version 4.0

6、0)對隨機(jī)挑取的384個fosmid克隆的雙向測序結(jié)果進(jìn)行微衛(wèi)星掃描，共發(fā)現(xiàn)了168個微衛(wèi)星序列。所得微衛(wèi)星序列使用PRIMER PREMIER version 5.0軟件共設(shè)計得到了101對擴(kuò)增引物，引物優(yōu)化后進(jìn)行PCR反應(yīng)，并以12％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。在所有成功擴(kuò)增的位點中，有64個位點檢測到了多態(tài)性，其中有50個符合哈迪一溫伯格平衡。不同的引物獲得的等位基因數(shù)為2～9個不等，平均每對引物獲得4.1個等位基因。期

7、望雜合度(HE)為0.05～0.94，觀測雜合度(H0)為0.06～1.00。 4.從半滑舌鰨雌魚fosmid文庫中篩選性別相關(guān)序列本研究從fosmid文庫的測序結(jié)果中隨機(jī)挑取384個克隆的雙向測序結(jié)果，除去測序失敗的克隆后，使用PRIMER PREMIER version 5.0軟件設(shè)計PCR擴(kuò)增引物。設(shè)計結(jié)束后，從每個克隆的兩對引物中選取預(yù)期PCR擴(kuò)增結(jié)果較好的一對進(jìn)行合成，共得到了374對PCR擴(kuò)增引物。利用雌魚DNA池和

8、雄魚DNA池為模板對設(shè)計得到的引物進(jìn)行初步PCR擴(kuò)增篩選，退火溫度統(tǒng)一設(shè)定為50℃。對擴(kuò)增出差異的引物和沒有擴(kuò)增出明顯條帶的引物，利用溫度梯度PCR優(yōu)化每對引物的最佳退火溫度，并在最佳退火溫度下再次用雌魚DNA池和雄魚DNA池進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選和電泳檢測。對仍然擴(kuò)增出雌雄差異的引物，使用12個個體的DNA在其最佳退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以排除個體差異的可能。最終經(jīng)個體驗證后獲得了1對雌雄差異引物。該引物所對應(yīng)的克隆號為B169-47，