半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)性別決定的基因組學研究.pdf

1、半滑舌鰨是我國沿海特有的重要經濟魚類。由于其雌雄生長差異巨大,雄性個體生長速度過慢加大了養(yǎng)殖成本,嚴重阻礙了半滑舌鰨養(yǎng)殖產業(yè)的規(guī)模化推廣。因此,解決半滑舌鰨雌雄比例問題,實現全雌化養(yǎng)殖對于半滑舌鰨產業(yè)化發(fā)展具有重要意義。此外,半滑舌鰨性別決定系統(tǒng)為ZZ/ZW型,具有異型性染色體,并且發(fā)現存在天然性逆轉現象。因此,半滑舌鰨也是研究魚類性別決定和分化的理想模型。本文圍繞半滑舌鰨的性別決定和分化,從大片段基因組文庫構建及性別基因篩選、高密度遺

2、傳連鎖圖譜繪制及性別連鎖分析以及性逆轉的表觀基因組等基因組學研究的不同層面,初步分析了半滑舌鰨性別決定和分化的基因組學特點,為半滑舌鰨性別決定機制的解析奠定了基礎。其主要結果如下:
　　1.以pECBACI為載體,用BamHI和.HindIII內切酶構建了2個高質量的半滑舌鰨BAC文庫。2個BAC文庫共由55,296個克隆組成,空載率小于3.2％,平均插入片段約為156.4 kb,兩個文庫的覆蓋率約為半滑舌鰨單倍體基因組大小的13

3、.36倍。根據半滑舌鰨AFLP雌性特異標記和性別相關基因設計Overgo探針,進行同位素原位雜交,獲得228個陽性克隆,其中性別相關基因獲得陽性克隆76個,平均每個基因陽性克隆為15.2個,和BAC基因組覆蓋度基本一致;雌性特異標記獲得陽性克隆152個,平均每個標記獲得陽性克隆30個,為半滑舌鰨BAC基因組覆蓋度2倍多。利用.ABI3730常規(guī)測序獲得含有性別相關基因(Sox9、Dmnl和Cyp19ala)和雌性特異標記(CseF382

4、)的5個BAC陽性克隆全長序列,長度分別為127 kb(Sox9),145 kb(Dmrtl),165 kb(Dmrtl),107 kb(Cyp19ala)和135 kb(Cse382)。分析了含有Cyp19ala基因BAC全長序列的結構特點(重復序列、GC含量、轉座元件等),從BAC序列預測了9個基因,其中7個為已知基因。利用青鱂、斑馬魚、三棘刺魚、紅鰭東方鲀和黑青斑河豚的基因組序列開展了Cyp19ala基因的比較分析,發(fā)現該基因在不

5、同魚類具有結構和功能的保守性,主要包括所有魚類的Cyp19ala基因都具有9個外顯子和8個內含子;均含有5個保守的功能域;上游調控元件的保守性以及卵巢高表達的特異性等。
　　2.利用基于新一代測序技術的RAD-Seq構建了半滑舌鰨高密度SNP遺傳連鎖圖譜,并開展了全基因組性別連鎖分析。首先利用HiSeq2000對半滑舌鰨父母本進行了全基因組重測序,獲得reads數目分別為113 M和101M,測序深度分別達到16.8x和15.1x

6、,基因組覆蓋率達到92.8％和94.9％。經過嚴格的篩選條件,獲得父本雜合位點(1:1),母本雜合位點(1:1)以及雙親雜合位點(1:2:1)SNP數目分別為407,084個,397,300個和89,989個,覆蓋scaffolds的數目分別為3,553個,3,509個和1,925個,總長度分別為452 Mb,453 Mb和448 Mb,基因組覆蓋度達到96.2％,96.4％和95.3％。利用pstl酶切對F1代216個個體進行了RAD

7、-Seq,測序深度為0.4x,reads數目從2,275,870個-11,639,889個,平均為6,224,947個。經過篩選獲得RAD-tag數目從699,271個-1,134,343個,平均為913,371個。對F1群體基因分型的結果進行分離比檢驗(P=0.05),總共得到滿足分離比的13,116標記,其中母本雜合的標記為5,610,覆蓋scaffolds數目為1,018個,總長為396 Mb。父本雜合的標記為6,428,覆蓋sc

8、affolds數目為1,03l,總長為402 Mb。雙親雜合的1:1位點標記為1,078,覆蓋scaffolds數目為636個,總長為304 Mb。利用Joinmap3.0軟件從滿足分離比的13,116個標記均勻選取3,528個標記,初步構建了半滑舌鰨高密度SNP遺傳連鎖圖譜,包含22個連鎖群,其中常染色體連鎖群20個,性染色體連鎖群2個。平均每個連鎖群含有遺傳標記160個,總圖距為1999.535 cM,平均間距為0.568 cM/m

9、arker。標記覆蓋的scaffolds的總長為422 Mb,約占基因組大小的88.4％。利用高密度SNP遺傳連鎖圖譜開展了性別的全基因組連鎖分析,發(fā)現其他染色體上的LOD值均在2.5以下,而W染色體上所有的標記LOD值均顯著大于2.5,加性效應均為負值,表明w染色體上等位基因與半滑舌鰨性別決定具有顯著關聯性。
　　3.利用全基因組甲基化測序(WGBS)繪制了半滑舌鰨單堿基分辨率的全基因組甲基化圖譜,初步揭示了半滑舌鰨性逆轉的表觀

10、遺傳機制。利用IlluminaHiSeq2000完成了半滑舌鰨正常雌魚、正常雄魚和偽雄魚性腺的WGBS,獲得有效數據16.81 Gb,21.15 Gb和18.63 Gb,單鏈的覆蓋深度分別達到19.65x,25.39x和21.60，mCs約占基因組中所有胞嘧啶的8.67％、8.86％和8.76％。97％以上的甲基化位點都發(fā)生在CpG區(qū)域,并且絕大多數mCs都具有較高的甲基化水平。半滑舌鰨基因TSS兩側區(qū)域具有較低的甲基化水平,而在基因編

11、碼區(qū)、內含子以及3'UTR區(qū)域均具有較高的甲基化水平。所有的轉座元件(DNA、LINE、SINE、LTR等)均呈現出與基因組相似的甲基化水平,而簡單重復序列(Simple Repeat)和隨機重復序列(Tandom Repeat)則呈現出較低的甲基化水平。此外,在各種小RNA區(qū)域,則表現出不同的甲基化水平,在snRNA的下游區(qū)域具有較高的甲基化水平,在rRNA和tRNA區(qū)域甲基化水平相對基因組整體較低,而在miRNA區(qū)域則表現出與基因組

12、甲基化類似的水平。根據mCs所在的位置,將半滑舌鰨基因分為甲基化基因和非甲基化基因,在正常雌魚、正常雄魚和偽雄魚中,甲基化的基因為20,237個、20,183個和20,199個,占所有基因的97.03％,96.77％和96.85％,非甲基化的基因僅為619個、673個和657個。偽雄魚和正常雄魚基因組甲基化水平整體較為相似,均具有較高的甲基化水平,而與正常雌魚的差異顯著。正常雌魚和正常雄魚的DMRs達到了14.87 Mb,正常雌魚和偽雄